鲈鱼(Lateolabrax japonicus)属鲈形目,真鲈 科,因具有肉质鲜嫩、营养丰富、药用价值高、经济效益好等特点而被广泛养殖于各水产区.关于鲈鱼的研究主要集中在其含肉率、营养成分、新鲜度及野生群体的遗传多样性等方面.有关鲈鱼病原菌已报道的有诺卡菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维弧菌,但尚未见鲈鱼豚鼠 气单胞菌病的报道[1-4].豚鼠气单 胞菌(Aeromonas caviae)属弧菌科、气单胞菌属,可引起人类急性腹泻、败血症、膀胱炎、胆囊炎等[5-7].近年来,国内外研究者已从熊猫、红嘴鸥、虎纹蛙蝌蚪、金鱼、鲤鱼、虹鳟、欧洲鳗鲡、鲢鳙、丰产鲫、南方鲇等多种患病动物中分离出该菌[8].本研究从发病鲈鱼中分离到豚鼠气单胞菌,并对该菌的生物学特性和耐药性进行了研究,这将为鱼类豚鼠气单胞菌的鉴定及水产动物疾病的诊治提供科学依据.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病料 发病的鲈鱼采集自成都市某养殖场,体长24cm,体重400g.体表鳞片少量脱落,胸鳍、腹鳍和尾部轻微出血,肛门轻微红肿.腹腔内有淡黄色液体,肝脏严重充血.
1.1.2 试剂和仪器 普通营养琼脂、TSA-YE琼脂、SS培养基、生化鉴定管和药敏纸片,杭州微生物试剂有限公司产品;Taq PCR Master Mix,天根生化科技(北京)有限公司产品;PCR仪(EppendorfGermany)、电泳仪(BIORAD)、凝胶成像系统(Bio-RAD Laboratories Segrate Italy)、恒温培养箱,购自上海齐欣科学仪器科技有限公司 .
1.2方法
1.2.1细菌分离 无菌操作下取发病鲈鱼的肝脏划线接种于普通营养琼脂、TSA-YE平板和SS培养基上,28℃培养24h.挑取单菌落多次划线纯化培养,纯化后的菌株于4 ℃保存.再将纯化菌株分别划线于新的上述3种平板,28 ℃培养,观察菌落形态特征,并挑取单菌落经革兰染色后镜检.
1.2.2 生理生化鉴定 将上述纯化菌株穿刺接种于细菌生化鉴定管中,参考《伯杰氏系统细菌学手册》对菌株进行系统的理化特性的测定.
1.2.3 16SrDNA 基因的扩增 DNA模板制备:挑取纯化后的单个菌落于60μL的灭菌ddH2O中,-80 ℃冻存55 min后,迅速置于100 ℃沸水浴15min,之后12 000r/min离心5min,取上清液为粗提DNA模板.16SrDNA通 用引物上 游:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTTAG-3′, 下 游:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.PCR反应体系50μL:上、下游引物各1μL(引物浓度均为10μmol/L),DNA模 板4μL,Taq Mix 25μL,ddH2O 19μL.PCR反应程序:94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,30个循环;最后72℃4min.扩增产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测,阳性样品送上海生工生物工程技术服务有限公司测序.
1.2.4 系统发育树构建 通过NCBI的Blast系统将菌株SCLL2的16SrDNA序列与GenBank库中的序列进行同源性分析,将相似性较高的菌株及同属菌株作为内群,另选取弧菌(Vibrio)和邻单胞菌属(Plesiomonas)作为外群,利用Clustalx 1.83软件进行多序列比对,并结合MEGA 5.0软件中的邻近法(Neighbour Joining)和采用Jukes Cantor model矫正模型,自举1 000次构建系统发育树.
1.2.5 药敏试验 选用强力霉素、庆大霉素、先锋V、诺氟沙星等20种药物对菌株SCLL2作药敏试验.采用Kirby-Bauer扩 散 法,将0.5麦 氏 单 位(1.5×108CFU/mL)的菌悬液均匀涂布于普通营养琼脂平板,贴上药敏纸片,于28 ℃恒温培养20h~24h后观察抑菌圈的大小,依据美国临床实验室标准化委员会执行标准判定结果.
2结果
2.1细菌分离
经过多次纯化得到一株优势菌株,命为菌株SCLL2,该菌株在液体培养基中表面有薄菌膜.在营养琼脂培养基和TSA-YE琼脂上菌落呈圆形、灰白色、半透明、中央稍隆起、表面光滑湿润、边缘整齐.在SS琼脂上可生长,呈无色菌落.该菌经革兰染色后呈阴性,短杆状,两端钝圆,单个散在或成对分布.
2.2生理生化特性
该菌株具有动力性,产生H2S,分解半乳糖、蔗糖和甘露醇,山梨醇、侧金盏花醇,MR和V-P试验为阴性,氧化酶和接触酶阳性.其他特性见表1.参考《伯杰氏系统细菌学手册》,初步判定其为豚鼠气单胞菌.
2.3 16SrDNA的扩增结果与系统发育树分析
该菌株16SrDNA基因的扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1,得到大小为1 433bp的片段,与预期大小一致.将该片段序列提交至GenBank,登录号为KJ157321.该序列在GenBank库中的比对结果显示,菌株SCLL2的16SrDNA序列与豚鼠气单胞菌的序列相似性高达99%.选取相似性较高的同属菌株和其他菌株,运用生物信息学软件构建系统发育进化树,结果见图2.由图2可知,菌株SCLL2(图中"◆"标记)与豚鼠气单胞菌[KC202262.1]聚 为 一 支,与 嗜 水 气 单 胞 菌[JX478244.1]、[JX029046.1]、维 氏 气 单 胞 菌[AY987746.1]及A media[GU174504.1]、[FJ940809.1]聚为一簇.
2.4药敏试验
药敏结果显示,菌株SCLL2对强力霉素、四环素、美满霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、氯霉素、诺氟沙星、氟苯尼考等9种药物高度敏感,对红霉素、先锋霉素V、多黏霉素B等中度敏感,但对复方新诺明、磺胺异恶唑、甲氧卞胺嘧啶、利福平、洁霉素、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、菌必治等8种药物耐药.因此,临床治疗时可以选用高度敏感的强力霉素等交替使用.
3讨论
豚鼠气单胞菌广泛存在淡水和污水中,是一种人-鱼及多种动物共感染的病原菌.本研究从发病鲈鱼中分离到菌株SCLL2,在形态学和理化性质测定的基础上,进一步通过16SrDNA的序列分析和系统发育进化树的构建等方法最终确定该菌株为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae).郭秀平等[9]从虎纹蛙蝌蚪中分离鉴定出豚鼠气单胞菌,但该菌株在葡萄糖产气和H2S方面与模式豚鼠气单胞菌不同.
丁雷 等[10]研究表明,虹鳟豚鼠气单胞菌不产生H2S,与模式菌株的性质相反.本研究中,菌株SCLL2的理化特性与伯杰细菌手册上模式豚鼠气单胞菌的生物特性较为相似,但在枸橼酸盐利用方面与模式菌株存在差异.这可能由于气候、地区、寄主体、培养条件等不同而导致菌株间的性质存在不同程度的差异.
随着生物学的快速发展,多种技术在豚鼠气单胞菌检测中得到广泛应用,如间接ELISA法、单克隆抗体-胶体金法和环介导等温扩增技术等.
16SrRNA普遍存在于细菌的染色体基因组中,含高度保守及中度保守高度变化的序列区域,分子大小适合操作.
16SrRNA序列分析具有高效、简便、特异性强的优点,已成为微生物检测及研究其进化和亲缘关系的一种强有力工具.但由于数据库中16SrRNA基因的序列数量有限或有些存在不清楚位点,为序列分析带来诸多不便.另外该方法对亲缘关系较近的细菌的精确鉴定还存在一定难度.本研究对菌株SCLL2进行了16SrRNA基因序列及系统进化树分析,将分子生物学鉴定方法和常规的生理生化鉴定方法相结合,从而判定菌株SCLL2为豚鼠气单胞菌,两种方法相互补充,保证了细菌鉴定的准确性.
目前,在水产养殖中广泛使用抗菌药物对疾病进行防治,研究发现不同豚鼠气单胞菌菌株对抗菌药物的敏感性存在差异.孙红祥等[11]研究表明,中华鳖豚鼠气单胞菌对氟嗪酸、庆大霉素和氯霉素高度敏感,而对氨苄青霉素、利福平和复方新诺明耐药.李小波等[12]对丰产鲫豚鼠气单胞菌的药敏试验结果显示,该菌对链霉素、氯霉素、诺氟沙星敏感,对红霉素中度敏感,但对复方新诺明和氨苄青霉素耐药.许信刚等[13]研究表明,金鱼豚鼠气单胞菌对氯霉素、庆大霉素、卡那霉素和四环素高度敏感,对氨苄青霉素耐药.王意银等[14]对分离自腹泻患者的豚鼠气单胞菌的研究结果显示,分离菌对庆大霉素和诺氟沙星敏感,对氨苄西林和甲氧卞胺嘧啶耐药.本研究中菌株SCLL2对诺氟沙星、庆大霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素和甲氧卞胺嘧啶等的敏感性结果与上述研究结果是一致的.但中华鳖豚鼠气单胞菌与丰产鲫豚鼠气单胞菌对四环素和卡那霉素耐药,而金鱼豚鼠气单胞菌和菌株SCLL2对两种药物是高度敏感的.不同来源的豚鼠气单胞菌对药物敏感性研究结果不尽相同.这表明豚鼠气单胞菌对药物的敏感性存在差异,这与不同地方、不同养殖环境中使用药物的种类及使用程度有关.
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