miRNA 是一类长度为 18 ~ 22 个核苷酸的非蛋白编码的单链小分子 RNA,广泛存在于真菌、细菌、病毒、植物、哺乳动物等生物体内.miRNA 通过调控基因的表达参与细胞的早期发育、细胞增殖、细胞代谢、细胞凋亡等重要的生命过程.近几年,多种生物体液中发现了能稳定存在的 miRNA.血浆、尿液或其他体液中细胞外 miRNA 的异常表达与包括肿瘤在内许多种疾病有着密切关系.然而,目前有关miRNA 进入体液的具体分子机制尚不清楚.本文仅就细胞外 miRNA 的发现、来源及其生物学功能方面做一综述.
一、细胞外 miRNA 的发现
最早发现在生物体液中存在 miRNA 的是 Chim及其研究团队.2008 年,Chim 等[1]在研究中发现,孕期女性的血浆中有来自胎盘的 miRNA,确认了孕体血浆中 157 种 miRNA,其中 17 种 miRNA 在血浆中的浓度是孕妇外周血细胞的 10 倍以上并且在产后孕妇血浆中无法检测到.同年,Lawrie 等[2]在弥散性 B 细胞淋巴瘤患者的血浆中检出 miR-155、miR-210 和 miR-21a 这三种肿瘤相关的 miRNA 表达水平比正常对照组有升高,并据此提出将循环 miR-NA 作为疾病甚至肿瘤诊断标志物的设想.随后,Weber 等[3]在血浆、唾液、泪液、尿液、羊膜液、初乳、乳汁、支气管液、脑脊液、腹膜液、胸膜液、精液共 12种正常人体液中检测 miRNA 的存在,结果显示miRNA 在以上 12 种体液中都得以检出,说明 miR-NA 存在于人体多种体液之中.Zhang 等[4]以身体健康的中国人( 主食为稻米) 为研究对象在其血清与血浆中检测到了外源性的植物 miRNA,同时在其他动物的血清中也检测到了植物 miRNA.
二、细胞外 miRNA 的来源与运送途径在生物体内的过程
( 一) 细胞外 miRNA 的来源 血细胞与血浆完全接触,即使很小的血细胞数的变动或者细胞溶血的发生都会改变血浆 miRNA 的水平,许多被认为可以作为肿瘤标志物的循环 miRNA 在血细胞中的呈现高表达,因此,可以将血细胞认为是血浆中细胞外miRNA 的主要来源[5].然而,最近一项研究将AGO1 和 AGO2( Argonaute) 相关的血浆 miRNA 与全血细胞 miRNA 进行对比分析,结果显示在正常情况下血浆 miRNA 也可以来自其他组织器官[6].某些组织特异性的 miRNA,如 miR-122( 肝脏) 、miR-133a( 肌肉) 、miR-208a( 心脏) 以及 miR-124( 脑) 都已经在血浆中被检出.
肿瘤也能向血液中释放 miRNA.在肿瘤的不同阶段都可以在血液循环中发现多种肿瘤组织特异性 miRNA.并且肿瘤向其他细胞一样可以分泌包含 miRNA 的微囊泡( microvesicles,MVs) .Mitchell等[7]将人前列腺癌细胞种植在小鼠体内,发现来自于人前列腺癌的异种移植物可进入种植小鼠的体内循环,证实了体液中的 miRNA 不仅来源于宿主细胞( 小鼠) ,还有一部分是由肿瘤细胞分泌.
Zhang 等[4]研究发现人工喂以稻米、小麦、马铃薯等植物的小鼠在喂食后血清中植物 miR-168a 至少是喂食前的 3 倍,并且在肝脏、胃肠等脏器中发现该 miRNA 水平皆有明显增高,而在肾脏等其他器官中并未检测到此种变化,说明植物 miRNA 通过哺乳动物的摄食行为进入机体内部,通过胃肠道进入血液,这是目前发现的唯一的外源性植物 miRNA 进入机体的方式,也是细胞外 miRNA 的来源之一.
( 二) 细胞外 miRNA 的稳定性 研究者将核糖核酸酶加入新鲜人血清后检测 miRNA 的量并不会减少,说明血浆 miRNA 可在富核糖核酸酶的环境中较为稳定地存在.向血清中加入外源性成熟 miR-NA 则发现外源性 miRNA 在核糖核酸酶的作用下迅速降解.而在加有核糖核酸酶抑制剂的血清中外源性 miRNA 则不会降解.这也揭示了 miRNA 本身并不具有对核糖核酸酶的抗性,为研究者进一步探索miRNA 在体液中的存在形式提供了思路.
( 三) 细胞外 miRNA 在生物体内的运送过程在体液中发现 miRNA 之前,研究人员在细胞培养基中已经发现释放到细胞外的胞外体( exosome) 中含有 miRNA.机体中的 miRNA 可以通过囊化进入MVs 从而到达细胞外.而后,Hunter 等人在提纯的人外周血 MVs 中检测出了 miRNA,进一步证实了膜-囊泡结构保护 miRNA 的假设[8].Gibbing 等[9]研究发现 miRNA 包裹入胞外体可能不是一个随机事件,而是由特异性蛋白控制的; RNA 诱导的沉默复合体中的一个组分 GW182 在胞外体中表达极其丰富.而 GW182 是 miRNA 与 Ago2 相互作用发挥功能所必须的.胞外体被包裹进入 MVB 与神经酰胺有关.胞外体中含有大量的鞘磷脂及神经酰胺,而神经酰胺的合成受到中性鞘磷脂酶 2 ( neutralsphingomyelinase 2,nSMase2 ) 的控制.另有研究表明含有 miRNA 的胞外体进入 MVs,并由神经酰胺触发释放到细胞外.过表达 nSMase2 可以增加细胞外miRNA 的分泌,而使用特异性小干扰 RNA 或化学物质抑制 nSMase2 的酶活性则明显降低 miRNA 的分泌水平( Kosaka 等. 2010) .然而,Galas 等[10]研究显示 MVs 包裹并不是 miRNA 进入细胞外的唯一途径.在人工培养细胞的培养液中收集的 miRNA 大多数并不是来自于脱落囊泡和胞外体.同年,两篇研究性文章各自证实了大部分细胞外 miRNA 不仅和膜-囊泡结构无关而且 AGO 蛋白有关.在去除细胞碎片的血浆中只有很小一部分的 miRNA 与 MVs相关,90% ~95% 的 miRNA 是以和 AGO 蛋白结合的形式存在( Arroyo 等. 2011) .正常条件下人工培养的细胞所分泌的 miRNA 99% 左右与膜囊并无关系,而是同 AGO 蛋白结合( Turchinovich 等. 2011) .外源性 miRNA 由于其发现尚存在较大争议,目前也没有更多研究阐述其在生物体内的详细的转运过程.miRNA 进入受体细胞的方式仍不清楚,目前认为 MVs 可由内吞、内化等方式被受体细胞接受,而由 MVs 包裹的 miRNA 很可能借由这些过程进入受体细胞.
三、细胞外 miRNA 的生物学作用
( 一) 内源性细胞外 miRNA 的生物学作用
1. 胞外体介导的细胞间通讯: Zhang 等[11]研究发现 MVs 中的 miRNA 由循环进入靶细胞作为内源性 miRNA 调节多种靶基因或者信号事件.用人微血管内皮细胞系( HMEC-1) 作为受体细胞,含有来源于 THP-1 细胞 FITC 标记的 miR-150 的 MVs 能够进入 HMEC-1 细胞,miR-150 表达水平明显升高.
这一结果表明 miRNA 可以通过 MVs 传递到远处靶细胞.miRNA-150 过表达后,293T 细胞的培养上清中的 MVs 能使 HMEC-1 细胞中 c-Myb 蛋白的表达明显降低,HMEC-1 细胞的迁移能力增加.沉默THP-1 细胞内 miR-150 的表达,则发现缺乏 miR-150的 MVs 并不影响 HMEC-1 细胞中的 c-Myb 蛋白表达及 HMEC-1 细胞的迁移能力.采用 Dil-C16 标记THP-1 细胞来源的 MVs 经尾静脉注射给 C57BL /6小鼠,血管内皮层中 miR-150 表达水平明显升高.
动脉粥样硬化患者血浆中分离出的 MVs 中 miR-150水平较正常人升高,而这种患者的 MVs 可以使HMEC-1 细胞中 c-Myb 蛋白的表达明显降低,促进HMEC-1 细胞的迁移.这些结果表明病理状态下MV 中携带的分泌性 miRNA 可以到达受体细胞和组织发挥功能.
Pegtel 等[12]研究发现胞外体 miRNA 可以促进病毒感染.用 EB 病毒转化来源于 B 淋巴样干细胞的胞外体,通过体外共同培养实验病毒 miRNA 通过分泌的胞外体传递到未感染的细胞,并使 EVB-miR-NA 的靶基因 CXCL 的表达呈现出剂量依赖性抑制.
进一步对 EB 病毒负荷增加的人群的外周血进行分析发现,EB 病毒 DNA 仅存在于循环 B 细胞中,而EB 病毒 miRNA 却在 B 细胞及非 B 细胞同时出现,这也提示了循环 miRNA 可以进行细胞间的传递.Mittelbrunn 等[13]研究发现胞外体 miRNA 也参与免疫应答的调控.J77 T 细胞、Raji B 细胞及原代的树突状细胞分泌的胞外体中含有 miRNA,经抗原刺激可以诱导免疫突触的形成,促进 miRNA 从 T 细胞向抗原递呈细胞( antigen presenting cell,APC) 的单向性转移.而 miRNA-335 可以抑制 APC 中 SOX4mRNA 的翻译,进一步证实了转移到 APC 中的 miR-NA 在受体细胞中是有生物学功能的,揭示了由胞外体介导的抗原驱动的单向性细胞间 miRNA 的转移机制,而 miRNA 这种在免疫细胞之间的转移则可能会在免疫细胞之间信号传递,甚至在在免疫反应中调节基因表达.
此外,研究表明在体外 miR-133b 可以通过胞外体由间充质干细胞转移到星形胶质细胞和神经细胞.肿瘤细胞分泌的 miRNA 可能会影响周围正常细胞的表达谱,从而影响肿瘤进展,但尚未在体内试验进行验证.
2. 特异的循环 miRNA 表达谱可作为肿瘤及其他疾病的新型生物标记物: 已有研究报道某些生理病理条件下可能会得到较为独特的循环 miRNA 谱.由于细胞外 miRNA 可在血浆、血清中稳定存在,可考虑以不同血清 miRNA 作为不同疾病的标记物.Chen 等[14]将 11 个非小细胞肺癌患者( non-smallcell lung cancer,NSCLC) 的血清进行汇集测序,并与正常人的血清 miRNA 进行对比,发现 NSCLC 患者的血清出现 63 种不存在于比正常人血清中的 miR-NA,而 28 种正常人血清 miRNA 也未能在 NSCLC 患者的血清中检出.NSCLC 患者的血清 miRNA 表达谱同时与血细胞 miRNA 表达谱进行比较,发现两者共有的 miRNA 有 57 种.而 76 种 miRNA 仅在NSCLC 患者的血清中检出,这一结果同正常人血清miRNA 与血细胞 miRNA 表达谱的比较结果差异较大.他们进一步对结肠癌和糖尿病患者的血清miRNA 进行了测序,发现在结肠癌患者血清中发现了 69 种正常血清中为检测到的 miRNA,值得注意的是许多 miRNA,如 mi-134、mi-221 等在肺癌和结肠癌患者血清中都有发现,并且不存于正常人血清中,这一结果提示血清中可能存在某些肿瘤相关miRNA.
( 二) 外源性细胞外 miRNA 的生物学作用Zhang 等[4]发现外源性的植物 miR-168a 可以被小鼠消化道吸收,进入血循环及胃、小肠、肝脏等多种脏器,与靶基因低密度脂蛋白受体衔接蛋白 1( low-density lipoprotein receptor adapter protein 1,LDLRAP1) 结合,从而抑制其在肝脏中的表达,减缓低密度脂蛋白从血浆中的清除.在人类小肠上皮细胞 Caco-2 中高表达 miR168a,并用 Caco-2 的 MV 处理 HepG2,结果发现 HepG2 细胞中 miR-168a 水平也有升高,而 LDLRAP1 的蛋白水平降低.这一研究结果表明外源性植物 miRNA 可以通过哺乳动物的摄食行为进入其体内,调控靶基因表达从而影响摄食者的生理功能.
四、结语与展望
目前研究已经证实细胞外 miRNA 能够在血清中稳定存在,并且广泛存在于人体 12 种体液中.细胞外 miRNA 由体内细胞分泌或通过摄食行为由胃肠道吸收,进入循环中,被靶细胞摄取,调节靶基因或信号事件,起到了细胞间的通信作用.然而,还有许多关于细胞外 miRNA 的问题需要进行进一步的研究: miRNA 是否由细胞选择性分泌,具体是如何进行分拣进入微囊泡中或与 AGO 等蛋白结合? 循环 miRNA 如何被靶细胞识别并摄取? 什么机制触发了 miRNA 由远端部位的释放? 此外,研究 miR-NA 的终极目标在于对人类疾病的预测、预后以及治疗上的价值.尽管目前这一研究领域仍处于探索阶段,但相信其在细胞间通信以及疾病的诊断和治疗都将产生重大影响.
参 考 文 献
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4 Zhang L,Hou D,Chen X,et al. Exogenous plant MIR168aspecifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA. Cell Res,2012,22 107 ~ 126.
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13 Mittelbrunn M,Gutierrez-Vazquez C,Villarroya-Beltri C,etal. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomesfrom T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun,2011,2282 ~ 292.
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