地球自转（约２４ｈ）形成白天黑夜，生物为了适应在地球上的生活，所有生命活动均按照一定的规律周期性运行，这些生命活动现象称为生物节律（ｂｉｏｌｏｇｉ－ｃａｌ ｒｈｙｔｈｍｓ）。生物节律存在于整个机体之中，并存在于离体器官和单细胞中，其产生的机制是由中枢下丘脑视交叉上核 （ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｓｕｐｒａｃｈｉａｓｍａｔｉｃ ｎｕ－ｃｌｅｕｓ，ＳＣＮ）调控细胞水平上的基因转录与转录后的分子振荡引起［１］。当生物节律基因被转录后，相应蛋白经历转录后的修饰，调节下游基因如血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）的表达，从而影响肿瘤的发生发展［２］。本实验检测不同浓度ＣｏＣｌ２诱导人食管癌细胞化学性低氧环境，并检测不同浓度对癌细胞的增殖毒性；采用定量ＰＣＲ比较持续黑暗与正常光暗循环的条件下，ｐｅｒ２节律基因与下游基因ＶＥＧＦ的节律相位关系。
１材料与方法
１．１ 细胞株和试剂及仪器
人食管癌细胞株Ｅｃａ－１０９购于南京凯基生物科技发展有限公司，其他还包括培养箱（ＳＡＮＹＯ公司，日本）、ＲＰＭＩ１６４０培 养 液 （ＢＩＯＭＥＧＡ，美 国 ）、双 抗（ＨＹＣＬＯＮＥ，美国）、胎牛血清（ＨＹＣＬＯＮＥ，美国）、胰蛋白酶（Ａｍｒｅｓｃｏ，美国）、Ｂｉｏｚｏｌ ＲＮＡ提取试剂盒（ＢＩＯＭＥＧＡ，美 国）、逆 转 录ＰＣＲ试 剂 盒 （Ｆｅｒｍｅｎ－ｔａｓ）、荧光定量ＰＣＲ试剂盒（ＢＩＯＭＥＧＡ，美国）、引物合成（上海捷瑞生物工程有限公司）、ｃｃｋ－８试剂盒（南京凯基 生物科技发展有 限公 司）、氯 化 钴 （ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ）晶体粉末（成都市科龙化工试剂厂）、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，美国）、９６孔培养板及安图酶标仪（郑州安图生物工程有限公司）。
１．２细胞培养
将人食管癌细胞株Ｅｃａ－１０９培养于含１０％胎牛血清 的ＲＰＭＩ１６４０培 养 液 中，青 霉 素 和 链 霉 素 各１００Ｕ／ｍＬ，ｐＨ７．２～７．４，培养箱内温度３７ ℃、５％ＣＯ２和２０％ Ｏ２饱和湿度。实验组用铝箔纸包裹制造持续黑暗条件，对照组正常光暗循环。
１．３ ９６孔板细胞培养
每个孔用２００μＬ含０．８×１０４个细胞密度培养液，分别做３个复孔。在细胞检测前２４ｈ，换用含不同浓度ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ的完全１６４０培养液培养。Ａ～Ｈ组 分 别 表 示 含０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００和４００μｍｏｌ／Ｌ浓度的ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ完全培养液。
１．４ 引物设计与合成
内参ＧＡＰＤＨ引物、ＶＥＧＦ引物设计参考文献［３］。ｐｅｒ２基因引物的上游引物为５′－ＣＴＣＴＣＣＴＧＧ－ＧＣＴＡＣＣＴＡＣＣ－３′，下游为５′－ＣＧＴＧＡＴＧＴＡＣＴＣＴ－ＣＣＧＴＴＣＣ－３′，产物大小１７３ｂｐ；ＶＥＧＦ基因引物上游为５′－ＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＣ－３′，下游为５′－ＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡＣＴＣ－３′，产物大小１４２ｂｐ；ＧＡＰＤＨ基因引物上游为５′－ＴＧＧ－ＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴ－３′，下游为５′－ＴＧＡ－ＡＧＧＧＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡ－３′，产物大小１１１ｂｐ。
１．５ 增殖毒性的ｃｃｋ－８检测
检测前将每孔培养于不同浓度ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ溶液的癌细胞，换用１０％ ｃｃｋ－８的培养液１００μＬ，在培养箱中孵育２．５ｈ，在酶标仪上测光吸收值Ａ４５０，参考波长为Ａ６２０，计算细胞抑制率。
给药组指的是Ｂ～Ｈ浓度组。
１．６ ｐｅｒ２与 ＶＥＧＦ的表达
实验组（避光低氧组）用铝箔纸包裹培养瓶，避免光线透过培养瓶；对照组（低氧组）均放入３７ ℃、５％ＣＯ２和２０％ Ｏ２饱和湿度有正常光暗循环的培养箱中，提取ＲＮＡ前２４ｈ换用浓度为１５０μｍｏｌ／Ｌ ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ的完全培养基。低氧培养２４ｈ后，于第２天７：００、１１：００、１５：００、１９：００、２３：００和０３：００，第３天７：００提取ＲＮＡ，逆转录为ｃＤＮＡ，根据定量ＰＣＲ方法检测ｐｅｒ２与ＶＥＧＦ基因的表达。
１．７ 数据分析
３组数据采用定量ＰＣＲ相对定量方式中的Ｃｔ值比较法来测定基因表达的差异。
Ｅ为 基 因 扩 增 效 率。Ｅｐｅｒ２＝９４．２％，ＥＶＥＧＦ＝９２．２％，ＥＧＡＰＤＨ＝９９．９％。基因扩增效率数据来源于定量ＰＣＲ标准曲线的制作。
Ｃｔ值由定量ＰＣＲ得到，定量ＰＣＲ数据以Ｃｔ均值表示，结果以ｘ－±ｓ表示。
１．８统计学方法
ｃｃｋ－８和定量ＰＣＲ各３组数据均采用ＳＰＳＳ １３．０进行统计学处理，ｃｃｋ－８数据采用完全随机设计资料的方差分析，定量ＰＣＲ数据采用配对ｔ检验分析，实验结果以ｘ－±ｓ表示。检验水准α＝０．０５。
２结果
２．１ ＣｏＣｌ２对 Ｅｃａ－１０９增殖的影响
ＣｏＣｌ２制造癌细胞化学性低氧环境，不同浓度对人食 管 癌 细 胞 的 增 殖 性 影 响 不 同 （图１）。 在１５０μｍｏｌ／Ｌ的浓度下，对食管癌细胞的抑制率最低，食管癌细胞生长对数期最早到来，食管癌细胞生长状况最佳。低浓度５０、１００和１５０μｍｏｌ／Ｌ ＣｏＣｌ２培养食管 癌 细 胞 抑 制 率＜０，说 明 促 进 癌 细 胞 的 增 长。２００μｍｏｌ／Ｌ对 细 胞 增 殖 有 轻 微 抑 制 作 用。高 浓 度２５０、３００和４００μｍｏｌ／Ｌ对癌细胞的生长状况有严重抑制致，几乎不能生长，甚至致死。
２．２ ｐｅｒ２和 ＶＥＧＦ的表达
图２所示，每个图只有１个波峰，表示只有１种基因，分别是ｐｅｒ２和ＶＥＧＦ。ｐｅｒ２的解链温度是８６．５℃（目测），ＶＥＧＦ是８４．５℃（目测）。如图２～图４所示，食管癌Ｅｃａ－１０９细胞无论持续黑暗（实验组）还是正常光暗循环（对照组）条件下，ｐｅｒ２与ＶＥＧＦ的表达均呈自发节律性变化；２种条件下ｐｅｒ２表达高峰位于１９：００，低峰为７：００，ｔ１９：００＝６０．６２，ｔ７：００＝－２０．２７，Ｐ＜０．０５；ＶＥＧＦ低峰位于１９：００，高峰为０３：００，呈高低峰相位相反状况，ｔ３：００＝－１３．８６，ｔ１９：００＝－３０．００，Ｐ＜０．０５。
３讨论
食管癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，２０１２年度全国发病率居男性全部恶性肿瘤第４位，死亡率居第４位；女性发病率第７位，死亡率居第５位［４］。目前食管癌的治疗方式有很多，手术是治愈肿瘤的最好方式，但难以完全切除瘤组织和亚临床病灶，放疗和化疗就显得尤为重要［５－６］。但是这２种方式均有较大的毒副作用，周围正常组织的耐受剂量很大程度上限制了肿瘤的治疗，进一步提高疗效和最大程度减少对正常组织的损伤是值得研究的课题。时间生物学的出现解决了这一问题。
所谓时间生物学是研究生物节律的学科。生物节律的紊乱会导致肿瘤的发生发展，生物节律基因ｐｅｒ２通过负性调节ＶＥＧＦ，进而影响肿瘤血管的生成［７－８］。众所周知肿瘤没有血管供给营养，数年也不会＞２ｍｍ３［９］。
人类的各种生命活动现象都遵循生物节律基因的调控，生物节律基因受到光线的引导［１０］。在本实验中，离体培养人食管癌细胞株Ｅｃａ－１０９，ｐｅｒ２与ＶＥＧＦ基因的表达并没有受到光线的影响，不管培养条件是持续黑暗还是正常的光暗循环，都按照自身的节律表达，原因可能是生物体的视网膜神经节细胞中的一小部分细胞分泌的视黑质，将光线转换成光信号传至ＳＣＮ，再调节生物节律基因，进而得以重置［１１－１２］。而体外培养的食管癌细胞并没有这个输入系统，同时本实验亦是证实了这点。
本实验采用定量ＰＣＲ的方法比较持续黑暗与正常光暗循环培养条件下，人食管癌细胞节律基因ｐｅｒ２与ＶＥＧＦ基因的表达。结果显示，２种条件下两者节律表达高低峰相位呈相反状况，说明ｐｅｒ２在食管癌细胞中对ＶＥＧＦ的表达起到负性调节作用。
Ｐｅｒ２在人体内，属于一种保护性基因，上调抑癌基因ｐ５３的表达，抑制癌基因ｃ－ｍｙｃ表达，增加ＤＮＡ的修复能力，ＤＮＡ损伤减少，细胞生存能力增强，抑制肿瘤的发生，同时使ＶＥＧＦ的表达下降，影响肿瘤血管的生成，达到抑制肿瘤的生长与转移的目的［１３］。
在体内的肿瘤细胞，存在天然的低氧环境，低氧转录 因 子 （ｈｙｐｏｘｉａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１，ＨＩＦ－１）只有在低氧环境下，才能不被分解并结合下游ＶＥＧＦ基因序列的缺氧反应元件（ｈｙｐｏｘｉａ ｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＨＲＥ）５′－ＲＣＧＴＧ－３′上 调 其 转 录，因 此ＶＥＧＦ得到表达［１４－１５］。但离体培养的人食管癌细胞，生活在３７℃饱和湿度的正常氧气浓度的培养箱中，很难检测到ＶＥＧＦ的表达［１６］。因此，本实验将ＣｏＣｌ２加入细 胞 培 养 液 中，Ｃｏ２＋通 过 置 换 细 胞 内 氧 感 受 器Ｆｅ２＋，造成化学性低氧环境，模拟体内低氧环境使得ＶＥＧＦ得以表达［１７］。
低浓度的ＣｏＣｌ２细胞培养液，可以促进食管癌细胞的生长，并且在１５０μｍｏｌ／Ｌ浓度下最为明显，癌细胞生长对数期提前到来，且增殖毒性最小；＞２００μｍｏｌ／Ｌ的高浓度ＣｏＣｌ２细胞培养液，使肿瘤细胞严重缺氧，造成细胞代谢紊乱，严重抑制食管癌细胞的生长，几乎不能生长，甚至致死。因此，本实验采用了１５０μｍｏｌ／Ｌ浓度的ＣｏＣｌ２加入到细胞培养液中。
现在肿瘤的治疗方式很多，而抗血管生成已经成为肿瘤治疗的新策略，血管拮抗剂贝伐单抗（Ｂｅｖａｃｉ－ｚｕｍａｂ）拮抗ＶＥＧＦ的生成达到阻止肿瘤血管生成的目的［１８］。本实验通过对ｐｅｒ２及ＶＥＧＦ的生物节律的研究，试想能否在有限的拮抗条件下，采用不同的时间给药，以达到最佳的治疗效果，即为本实验的初衷也是本实验想尽的一点绵薄之力。
参考文献
［１］Ｒｅｓｚｋａ Ｅ，Ｐｅｐｌｏｎｓｋａ Ｂ，Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｒｏｔａｔｉｎｇ ｎｉｇｈｔ ｓｈｉｆｔ ｗｏｒｋａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃａｄｉａｎｒｈｙｔｈｍ［Ｊ］．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｗｏｒｋ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ，２０１３，３９（２）：１７８－１８６．
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