慢性病毒感染是肿瘤发生的病因学之一,目前发现多种病毒感染与妇科肿瘤高度相关,如人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)[1],单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes simplex virus II,HSV-2)[2]和巨细胞病毒(Cytomegaoviyns,CMV)[3]
感染与子宫颈癌高度相关,EBV(Epstein-barr virus,EBV)感染增加乳腺癌的发病风险[4].JCV自从1971年从一多发性脑白质变性患者(John Cunningham)脑脊液中被分离出来开始,在长达近五十年的过程中,医学界对该病毒的认识一直局限在JCV与进行性多发性脑白质变性(PML)的相关性上[5].如所有的多瘤病毒一样,JCV基因组编码有早期蛋白大小T抗原及晚期蛋白VP1,VP2,VP3和Agno,早晚期编码序列间由一个双向调控区间隔开来[5].研究显示多瘤病毒的T抗原具备以下生物学功能:
①大T抗原通过抑制p53,Rb家族等抑癌基因从而启动细胞转化而致瘤;②小T抗原通过抑制pp2A磷酸酶来维持由大T抗原造成的细胞转化过程[6].近十年来,多瘤病毒的研究推进非常快,主要体现为:
①新的种属不断被发现,如KI病 毒 (Karolinska Institutet virus,KIV)和WU病 毒 (Washington University virus,WUV)[5];②多瘤病毒感染与肿瘤发生的相关性越来越明确,如默克细胞多瘤病毒(Merkel cell poly-omavirus,MCV)被世界卫生组织列举为7大致瘤病毒之一[7].
JCV的最初侵入部位认为是扁桃体,通常不引起急性感染和病毒血症,在扁桃体进行复制后,随淋巴细胞带入肾脏及骨髓,受机体免疫压制可长期潜伏在肾脏及骨髓里[8].潜伏在肾脏中的病毒可以连续通过尿液排出;潜伏在骨髓中的病毒可以在机体免疫功能下降时扩散至中枢神经系统[5-8].世界各地的流行病学数据显示普通人群JCV核酸尿样中的检出率为50%左右,抗JCV抗体阳性率为30%~80%[5],说明该病毒在世界范围内广泛分布流行,因此医学界开始重新审视这一广泛流行的多瘤病毒.最近国外研究显示JCV感染与神经系统及消化系统肿瘤高度相关[5],然而,JCV的感染与妇科疾病尤其是妇科肿瘤间的关系国内外都鲜有报道.
本研究在建立JCV核酸检测方法及规程的基础上收集子宫肌瘤、子宫颈癌、子宫内膜癌及卵巢肿瘤患者临床资料、活检组织及血、尿样,采用PCR检测技术研 究 子 宫 颈 癌 高 度 相 关HPV,HSV-2,CMV,EBV及多瘤病毒JCV和BKV在上述不同妇科肿瘤患者各样本中的检出率,探讨了多瘤病毒感染与上述肿瘤间的相关性.
材料与方法
1、研究对象 子宫肌瘤(98例)、子宫颈癌(84例)、子宫内膜癌(40例)、卵巢肿瘤(72例)患者全部为本院住院病人,排除患有进行性多发性脑白质变性、肾炎、上呼吸道感染、肺炎等疾病,在患者知情同意下,收集其临床资料、活检组织及血、尿样.各肿瘤诊断均为病理诊断.
2 、HPV (限子宫颈癌高度相关13种基因型),HSV-2,CMV及EBV检测 患者活检组织在送病理检查的同时,生理盐水清洗后研磨,取碎渣0.1mg,采用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue kit试剂盒提取总DNA后置于-80℃冰箱登记保存,子宫颈癌高度相关HPV,HSV-2,CMV核酸检测分别采用罗氏公司的AMPLICORR○Human PapillomavirusTest,The LightCyclerR○HSV 1/2Qual kit及CO-BAS AmplicorCMV Monitor.EBV核酸检测采用QIAGEN公 司artusEBV LC/TM/RG PCR kit.其中罗氏公司AMPLICORR○Human Papillomavir-us Test能检测出13种(HPV DNA genotypes 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59and68)跟子宫颈癌高度相关的HPV,任何一种HPV被检测为阳性即判定为HPV阳性.
3 多瘤病毒BKV及JCV检测 多瘤病毒家族中,JCV及BKV都认为可以导致病毒尿症,而且这两种病毒在DNA序列上有75%的同源性[5],因此无论是核酸诊断还是血清学诊断,区别这两种病毒都是一个重要环节.本研究在吸收国际同行检测经验的基础上,针对BKV及JCV分别设计出5组引物,采用各种样本,实施大量PCR预检测,同时将PCR产物进行克隆测序,最后确认运用在本研究中的BKV核酸检测引物为:正向引物(5′TTGCAGTA-CAGGGTATCTGG3′); 反 向 引 物 (5′GCCT-GATTTTGGAACCTGGA3′).JCV核 酸 检 测 引物为:正 向 引 物 (5′ATG AAC ACA GAG CACAAG GG3′);反向引物(5′GGA CAA CTT ACAACC CAA GGA C3′).血清病毒DNA提取采用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue kit试剂盒.尿液JCV和BKV核酸检测,国际同行主要采用离心方法富集病毒,即收集1~2ml尿液,15 000r/min离心5~15min,虽然有研究人员尝试过使用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)和经典病毒纯化分离方法来加强病毒富集过程,但发现这些方法并没有提高这两种病毒的检出效率,病毒可能存在于尿液中的脱落细胞或者盐结晶中,从而使15 000r/min能达到最大的富集效果.本研究尿样病毒DNA提取过程如下:收集患者中段尿1.5ml,置于2ml离心管中,4℃15 000r/min离心15min,弃去液体并用滤纸吸干,沉淀物用10μl生理盐水重悬后,采用QIAGEN公 司QIAamp MinElute Virus Spin kit提取DNA.病毒DNA提取后保存在-80度冰箱中.待样本收集完成后统一实施PCR检测.多瘤病毒BK及JC采用SYBR green定量PCR法.使用含 有BKV(参 考 株V01108)和JCV(参 考 株JQ237146)VP1序列的质粒作为阳性标准品,阳性标准品经过计算稀释成100~1 000 000拷贝/ml.
本研究中,将荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数低于或等于100拷贝/ml阳性标准品的循环数的检测样本判定为JCV或者BKV阳性,所有阳性样本的PCR产物同时实施测序确定检测敏感性及特异性.
结果
1、多瘤病毒BK及JC检测引物的确立
多瘤病毒家族目前已累计有10种[5],如表1所示,只有BKV及JCV被报道与泌尿生殖系统感染有关.而且BKV跟JCV在核酸水平上有75%的同源性,目前血清学检测还不能达到区别两种病毒抗原或抗体的水平,虽然国外普遍采用PCR法检测病毒核酸,PCR检测的特异性-如何鉴别BKV还是JCV是有一定挑战性的.本研究中,我们采用两种策略确保核酸检测的特异性.第一,收集所有NC-BI中的BK(501株)及JC(772株)病毒全长序列,综合分析这些序列的保守区同时又能区别两种病毒的核酸序列,分别设计合成五对候选引物;第二,利用五对引物,同时扩增100例尿样,其中20例为BKV核酸阳性,25例为JCV核酸阳性,10例为BKV及JCV核酸双阳性,评价筛选这些引物的特异性.以上阳性标本均通过本实验室和合作单位经过PCR病毒全长克隆测序鉴定,阴性判定标准为:
1)采用定量PCR法检测时无特异检测信号;2)前期病毒全长克隆用引物行病毒核酸扩增时无DNA片段出现.最终确立位于病毒结构蛋白VP1区域 的 引 物F(5′TTGCAGTACAGGGTATCT-GG3′)和R(5′GCCTGATTTTGGAACCTGGA3′)能检 测 和 鉴 别 检 测BKV;引 物F(5′ATG AACACA GAG CAC AAG GG3′)和R(5′GGA CAACTT ACA ACC CAA GGA C3′)能检测和鉴别检测JCV.
2、多瘤病毒BKV及JCV检测样本的确立
JCV及BKV检测工作的第二个重要点就是样本选择,多瘤病毒BKV及JCV被认为同时可以造成病毒血症及病毒尿症,但是实际上BKV及JCV的自然史还不清楚,大量早期研究在病毒核酸检测的特异性上值得怀疑,且在血样或者尿样这两种样本选择上几乎没有依据.采用前面确立的引物及PCR检测体系,同时并行检测上述100个个体血清及尿样,结果显示BK尿样检出率为51%高于其血样中的检出率22%,病毒核酸如果血样中能检出,其对应尿样一定也能检出,反之,尿样核酸检出阳性的患者,其对应的 血样只有不到一半是阳性.
JCV尿样的检出率与BKV类似为52%,而血样中检出率为0.因此对于这两种多瘤病毒来说,最佳的检测样本应该选尿样.
3、多瘤病毒BKV及JCV感染与妇科肿瘤的关系
在前面建立了多瘤病毒BKV及JCV检测方法及样本选择的基础上,我们进一步研究了这两种病毒感染与妇科肿瘤的关系,收集子宫肌瘤(98例)、子宫颈癌(84例)、子宫内膜癌(40例)、卵巢肿瘤(72例)患者的活检、血、尿样本核酸提取物,采用荧光PCR检测BK及JC在各患者组中感染情况.
为了全面地研究多瘤病毒核酸分布规律,我们在患者检测中同时并行检测了尿样,血样及活检样本.如表2所示,BKV在子宫肌瘤、子宫颈癌、子宫内膜 癌、卵 巢 肿 瘤 患 者 尿 样 中 的 检 出 率 分 别 为51.0%,48.8%,52.5%和48.6%,各妇科肿瘤组间分布无显著差异,结合国际同行报道[5],BKV感染可能跟上述妇科肿瘤无关.在血样中的检出率分别为24.5%,23.8%,25.0%和26.4%.血样阳性的患者其尿样全部阳性,尿样阳性的患者有近一半血样为阴性.活检样本中BKV核酸检出规律跟血样非常类似,即,血样检出阳性患者,其活检组织病毒核酸几乎阳性.这些结果进一步说明了病毒在尿样中的检测率比血样高.
JCV虽然与BKV有着紧密联系,但是其核酸检出率分布规律却有着自己的特点,第一,JCV在子宫肌瘤、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢肿瘤患者尿样中的检出率分别为65.3%,51.2%,55.0%和51.4%,该病毒核酸在子宫肌瘤患者组中的检出率显著高于其它妇科肿瘤组,而其它患者组中的检出率接近普通人群水平.以子宫颈·癌、子宫内膜癌和卵巢肿瘤患者合并(N=196,平均阳性率为52.0%)为对照组卡方检验显示P=0.034 2,说明JCV感染与子宫肌瘤高度相关.第二,JCV在血样及组织样本中的检出率几乎为0,综合JCV及BKV核酸检出分布规律,组织样本中的BKV核酸可能是通过血液循环分布到肿瘤组织中的.
4 、HPV、HSV-2、CMV、EBV感染及合并 感染检测病毒感染可以导致很多肿瘤发生,如表3所示,妇科肿瘤中,HPV、HSV-2及CMV感染与子宫颈癌高度相关,EBV感染与乳腺癌有关[1-4].既然上面的研究显示JCV感染与子宫肌瘤有关,有必要检测被研究人群中HPV、HSV-2、CMV及EBV感染及合并感染情况.
如表3所示,子宫肌瘤(98例)、子宫颈癌(84例)、子宫内膜癌(40例)、卵巢肿瘤(72例)患者的活检样本抽取核酸后,采用罗氏公司及QIAGEN公司的检测试剂盒及检测自动化平台,同时检测子宫颈癌高度相关HPV、HSV-2、CMV及EBV感 染 情 况.
HSV-2,CMV及EBV检出率几乎为0,而子宫颈癌高度相关HPV平均检出率为10%左右,且在子宫颈癌患者组中其检出率高至19.0%.上述结果显示,我们的人群中,HPV感染跟子宫颈癌高度相关,其它病毒感染率很低,且HPV、HSV-2、CMV、EB及JC和BKV间无协同感染情况.
讨论
病毒感染与肿瘤发生的关系越来越明确,多瘤病毒拥有数个致细胞转化的病毒元件,如大T抗原、小T抗 原 及 人 体 细 胞 转 录 因 子 结 合 调 控 区域[5-6].流行病学研究显示,多瘤病毒BKV及JCV在人群中广泛流行,跟很多慢性感染病毒类似,其感染的隐匿性导致大家对其病理生理过程缺乏认识.
伴随生物医学研究技术的发展,多瘤病毒感染与人类疾病的关系越来越得到重视,最新的研究显示不同的多瘤病毒能感染不同的靶器官并能导致神经系统,呼吸系统,泌尿生殖系统及消化系统等疾病[5].
多瘤病毒BKV及JCV在基因序列、感染途径、自然史等方面高度类似,其最大共同点就是大部分人的尿液中能克隆出这些病毒的全长序列,说明其在泌尿系统中是持续存在并不断复制的[5-7].一个拥有致细胞转化功能的病毒长期存在于人体细胞内,其可能产生的病理生理影响有必要得到高度重视,虽然最新的国外研究显示JCV感染与多种肿瘤发生相关,但是多瘤病毒感染与妇科肿瘤的关系还是空白,本研究在建立多瘤病毒检测技术的基础上,研究了多瘤病毒感染与子宫肌瘤、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢肿瘤的关联性,我们的研究显示JCV感染与子宫肌瘤高度相关,进一步研究显示该关联性与已知妇科肿瘤病毒HPV,HSV-2,CMV及EBV感染无关,说明JCV感染与子宫肌瘤的关联是独立的.
多瘤病毒JCV及BKV都是于1971年分离鉴定出来的[9,10],国际上对多瘤病毒JCV及BKV的研究被忽视了三十年,近十年,多瘤病毒JCV及BKV在病毒学、病理生理学、流行病学等方面都进展很快[11],其感染造成的危害性正在进一步深入研究中,国内学者也越来越重视多瘤病毒感染的临床相关疾病[12],本研究既为子宫肌瘤的发病机理提供了新的病原学证据.
病毒感染的检测一般都是从两个方面着手,一是检测病毒的成分,如病毒核酸或者病毒蛋白质,在病毒学上,如果在患者样本中能检测出病毒核酸或蛋白就说明患者体内存在病毒即现症感染.二是检测病毒感染过程中,机体免疫系统所产生的抗体,仅仅抗体阳性只代表该患者被病毒感染过,不能确认是否为现症感染.而对于任何一个病毒的感染这两大诊断手段的确立都不是一件简单的事.虽然多瘤病毒感染广泛且具备致肿瘤的可能性,其血清学检测和核酸检测技术国内外都还没有确立起来.本研究首先确立了核酸诊断技术,同时确立了检测样本的选择.虽然病毒感染与肿瘤发生的关系可以通过在肿瘤组织中寻找病毒成分而得到进一步的证据,但是大多数病毒引起肿瘤都不是通过简单感染靶器官而产生的,病毒感染过程中可以通过慢性炎症,激活肿瘤发生机制等等病理生理过程导致癌变.
JCV与BKV一般可以通过检测大T抗原来确认肿瘤组织中是否存在病毒成分,然而JCV、BKV及猿猴空泡病毒SV40的大T抗原具备大量相同表位[13-14],因此其检测的特异性值得怀疑.本研究中采用了同时并行检测肿瘤组织,血、尿样中BK及JCV的核酸成分,发现虽然JCV感染与子宫肌瘤高度相关,但是子宫肌瘤中却检测不到JCV核酸,说明JCV感染可能是通过其它分子机制作用于子宫平滑肌而产生肿瘤的.
本研究中子宫肌瘤包括肌壁间肌瘤、浆膜下肌瘤及粘膜下肌瘤,子宫颈癌主要为鳞状细胞癌,子宫内膜癌包括弥漫型及局限型,卵巢肿瘤主要为卵巢上皮性肿瘤.
JCV感染与妇科肿瘤的关系有必要在累积大样本的基础上根据这些病理分类做更深入的研究.
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