γ - 干扰素是由 T 淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的具有免疫效应的分子,在内含子区 + 874 和+ 2109存在两个调控基因转录的多态性.在中国人群中发现,+874A 等位基因和与 +2109G 构成的单倍型 AG 在 HBV 感染者中的频率显着高于正常人群,提示这个单倍型人群具有较高的 HBV 感染风险[1].乙肝病毒携带者及部分乙肝患者的临床症状不明显,而忽视了对该类人群预防.遗传因素可能在藏区人群 HBV 感染率高方面起了重要作用,有人推测可能是通过影响相关的免疫应答反应而导致高感染 率[2].本 课 题 就 青 海 地 区 藏 族 人 群 中IFN - γ基因的 2 个多态性基因位点与慢性乙肝易感性之间的关系开展相关研究.
1 材料与方法
1. 1 研究对象
乙型肝炎组 250 例,为 2012 年 6 月 ~2012 年 9月期间在青海省传染病医院确诊的藏族乙型肝炎患者( 乙型肝炎组) .对照组 134 例( 正常对照组) ,来源于同一所医院的健康体检者.抽取静脉血 5 mL,EDTA - K2 抗凝,分装,- 80 ℃ 低温保存.
1. 2 研究方法
1. 2. 1 DNA 抽提
基因组 DNA 提取用北京康为世纪基因组小量抽提试剂盒.
1. 2. 2 目的片段扩增
使用 iPLEX GOLD ( Sequenom MassARRAY)对 PCR 引物进行设计( 见表 1) .
1. 2. 3 目的基因片段获取
按照 iPLEX GOLD 建议的 PCR 条件进行单碱基扩增,然后经过 SAP 消化、单碱基延伸,得到目的基因片段.
1. 2. 4 电泳、洗涤
根据 PCR 片段配置 1% 琼脂糖凝胶,用微量进样器将样品依次加入到胶孔中,120 v 条件下恒温电泳 10 h.取出样品,卸胶,放入 70% 乙醇中摇床固定 15 min,蒸馏水冲洗两遍.
1. 2. 5 飞行质谱表型分析
PCR 的产物在单个碱基延伸后将纯化的 DNA收集后采用时间飞行质谱技术进行表型分析.
1. 2. 6 统计学处理
用 SPSS17. 0 软件完成,考察 Hardy - Weinberg平衡以判断样本的代表性.实验数据中所有计量资料用算术平均值 ± 标准差表示,乙型肝炎组与正常对照组之间等位基因与基因型分布差异显着性检验采用 χ²检验,检验水准 α =0. 05.
2 结果
2. 1 IFN - γ + 2109C / T 位点
2. 1. 1 IFN - γ + 2109C / T 位点各基因型及等位基因频率的比较采用飞行质谱法检定 IFN - γ + 2109C/T 位点的基因型,结果见图 1.两组共检测 384 例患者,各基因型及等位基因频率( 见表 2) .
2. 1. 2 IFN - γ + 2109C / T 各组间基因型和等位基因分布频率的比较2. 2 IFN - γ + 874A / T 位点2. 2. 1 IFN - γ + 874A / T 位点各基因型及等位基因频率采用飞行质谱方法能有效地检定 IFN - γ +874A / T 位点的基因型,见图 2.两组共检测 384 例患者,各基因型及等位基因频率( 见表 3) .
2. 2. 2 两组共检测 384 例患者,各基因型及等位基 因频率( 见表 3) .
2. 3 基因型频率 Hardy - Weinberg 平衡检验将本实验所测实际值与预测值比较,经卡方检验,正常对照组与乙型肝炎组符合 Hardy - Weinberg平衡检验( P > 0. 05) ,证明研究对象符合遗传平衡法则.
3 讨论
本研究结果显示,IFN - γ +874、IFN - γ +2109基因位点多态性与青海地区藏族人群 HBV 感染的易感性可能无关; IFN - γ + 874 的等位基因 T 可能是一个保护性基因.
青海藏族人群是乙肝高发区,青海本地藏族人群的 HBV 携带及乙肝发病率明显高于全国水平[3].
大部分感染者在病程发展中均能清除病毒,仅有8% 左右的感染者演变为慢性肝炎.但是 HBV 病毒持续存在的原因目前尚不明确,即使在同一种族、年龄及性别相似的机体中,使用同一种方法感染相同的病毒亚型,也会产生不一样的后果,因此研究表明,遗传基因在 HBV 感染过程中起着很重要的[4].
IFN - γ 又叫Ⅱ型干扰素,IFN - γ 基因与免疫应答机制的启动和调节关系密切.研究已证实IFN - γ参与 HBV 病毒清除和机体免疫应答过程,其基因的多态性是否与青海地区藏族人群 HBV 感染的易感性有关,值得进一步探讨.
本研究结果经过证实 IFN - γ + 874 与 IFN - γ+ 2109 各位点与乙型病毒性肝炎易感性未见明显相关性.结果表明,+ 874 和 + 2109 位点在乙肝和正常对照组之间各基因型在各组间的分布频率比较均未发现有显着性意义.但是在实验结果中发现 +874 等位基因 T 在病例组和对照组基因频率分别为81. 6% 和 87. 7% ,对照组的基因频率高于病例组,表明等位基因 T 可能与乙肝患者的保护性有关.
此结果与 cheong 等[5]的研究结果一致,提示INF - γ 的基因位点可能与 HBV 感染以及发生发展过程中没有明确联系.本研究结果与 Ben - Ari等[6]的结果不一致,发现在慢性 HBV 携带者和健康者中内含子 +874 位点单核苷酸多态性分布有显着性差异,并且这一差异可能与 IFN - γ 产物水平高低有关,大多数患者比健康者产生的 IFN - γ 要少.本研究显示青海地区藏族 IFN - γ + 874 和+ 2109基因位点多态性在青海地区藏族人群 HBV及健康者中分布差异均无统计学意义. + 874 和+ 2109位点突变型基因能否影响 IFN - γ 产物表达,需要进一步证实.实验结果同时表明,青海地区正常藏族人群 IFN - γ + 874 等位基因 T 的频率高于青海藏族 HBV 人群,这暗示着藏族 IFN - γ +874等位基因 T 可能对乙肝具有保护性.由于基因间存在复杂的交互作用,所以单个等位基因变化不会是保护或者易感因素,几个 SNP 位点或者单体型的联合作用可能会成为 HBV 感染的易感因素.本研究对 IFN - γ 基因 + 874 和 + 2109 位点进行单倍型分析,连锁遗传的两种单体型 CT 和 AT 在病例组和对照组间无统计学差异,尚不能说明其与青海地区藏族人群 HBV 易感性有关.
青海地区藏族人群不同的生活方式,可能对其HBV 的高感染率有一定影响[7].本文对青海地区藏族人群 IFN - γ 基因启动子 + 874 和 + 2109 基因位点多态性与 HBV 易感性的研究结果也许受到多方面因素的影响.本实验结果没有显示此位点与乙肝易感性有着明确的相关性,因此我们对藏族群体的乙型病毒性肝炎易感性的特异性研究还有待进一步的深入,出现这种阴性结果的原因可能与样本的样本量少有关,需要进一步验证结果.
进一步查找 IFN - γ 对藏族 HBV 感染的易感基因型及单倍型对乙型肝炎病毒感染的预防有重要意义[8],对积累藏族群体免疫遗传学资料及了解其遗传多样性也具有重要的作用.
参考文献
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