摘 要： 线粒体相关内质网膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane, MAM)是细胞内线粒体与内质网间的物理偶联结构，在调节线粒体动力学、钙信号传递、脂质加工与运输、线粒体自噬以及内质网应激等过程中都发挥着关键作用，MAM的这些生理功能对于卵母细胞的成熟是十分重要的。近年来研究发现，MAM上的多种蛋白参与了卵母细胞的成熟过程。本文综述了国内外近年来MAM相关蛋白参与卵母细胞成熟过程的研究进展，为了解卵母细胞成熟调控机制、卵母细胞质量鉴定以及提高辅助生殖成功率提供新的思考方向。
关键词 : 线粒体相关内质网膜;卵母细胞成熟;线粒体动力学;钙离子转运;
Abstract： The specific sites of physical association between endoplasmic reticulum(ER) and mitochondria are known as mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane(MAM), which plays an important role in the regulation of mitochondrial dynamics, calcium signaling, lipid processing and transportation,mitochondrial autophagy and endoplasmic reticulum stress. These physiological functions of MAM are very important for oocyte maturation. It has recently become clear that many proteins in MAM are crucial for oocyte maturation. This article reviews the research progress of MAM involved in oocyte maturation in recent years in order to provide a new direction for understanding the regulation mechanism of oocyte maturation,oocyte quality identification and improving the success rate of assisted reproduction.
Keyword： Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane(MAM); Oocyte maturation; Mitochondrial dynamics; Calcium transport;
线粒体相关内质网膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane,MAM)是指线粒体与内质网之间距离很近但并不融合的区域，使细胞器既可以保持独立又可以彼此交流。由于细胞内这一特定区域中多种蛋白可以发挥不同的功能，MAM在线粒体动力学、钙信号传递、脂质加工与运输、线粒体自噬以及内质网应激等过程中都扮演着重要角色。近年来研究发现，MAM相关的多种蛋白参与了卵母细胞的成熟过程，这可能为监控卵母细胞成熟过程以及鉴定卵母细胞质量和发育潜能都提供了新的思路。随着辅助生殖技术的广泛应用，卵母细胞的质量越来越受到人们重视，本文简要探讨线粒体相关内质网膜与卵母细胞成熟之间的关联并分享相关进展。
1 、MAM概述
在过去的几十年中，科学家们通过电子显微镜和荧光显微镜发现，真核细胞中的内质网作为细胞中体积最大的细胞器并不是孤立存在的，而是与其他的许多细胞器形成接触位点，包括线粒体、高尔基体、过氧化物酶体、内质体、溶酶体、脂滴以及质膜等(Elbaz,Schuldiner,2011;Friedman,Voeltz,2011)。细胞器之间的接触位点被认为是细胞器之间距离很近但并不发生实质融合的区域，因此每个细胞器既可以保持自己的特性又可以与其它细胞器相互作用，协同调节细胞代谢、信号转导和基因表达等。
线粒体作为细胞的“能量工厂”，与内质网的接触位点已经成为当今的研究热点。在动物细胞和酵母(Saccharomyces cerevisiae)中都可以观察到内质网和线粒体之间的接触位点，其接触位点上的蛋白也已被广泛地研究，如线粒体融合蛋白(mitofusin,Mfn)、三磷酸肌醇受体蛋白(inositol 1,4,5,-trisphos‐phate receptor,IP3R)、电压依赖性阴离子通道蛋白(voltage-dependent anion channel,VDAC)、线粒体分裂蛋白1(mitochondrial fission 1 protein,Fis1)、B细胞受体相关蛋白31(B cell receptor associated pro‐tein 31,BAP31)、酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51(protein tyrosine phosphatase interacting protein 51,PTPIP51)和囊泡相关膜蛋白B(vesicle-associated membrane protein-associated protein B,VAPB)等(Iwasawa et al.,2011;Merkwirth,Langer,2008;Sz‐abadkai et al.,2006)。
线粒体与内质网之间的距离不是恒定的。例如粗面内质网上因为存在核糖体，线粒体外膜与粗面内质网之间的距离(约20～35 nm)就大于线粒体外膜与滑面内质网之间的距离(约10～15 nm)(Fi‐ladi et al.,2017)。MAM在调节线粒体动力学、钙信号传递、脂质加工与运输、线粒体自噬以及内质网应激等过程中都发挥着重要作用，线粒体与内质网之间的距离很可能会影响线粒体的功能(Row‐land,Voeltz,2012;Vance,Jean,2014;Kornmann,2013)。
2 、MAM的主要生理功能
MAM接触位点由多种蛋白构成，通过不同蛋白发挥其各自的功能，MAM参与调节了线粒体动力学、钙信号传递、脂质加工与运输、线粒体自噬以及内质网应激等过程(Rowland,Voeltz,2012;Vance,Jean,2014;Kornmann,2013)。
2.1、 参与调节线粒体动力学
细胞内的线粒体数量和形态是动态变化的，在细胞的不同时期以及细胞的各种生化反应过程中，通过调节线粒体的融合与分裂，能够使细胞发挥不同的功能。线粒体融合与分裂之间的相对平衡对维持线粒体质量及功能十分重要，动力学相关GTP酶在这一过程中起着关键作用(Gao et al.,2017)。
MAM参与调节线粒体的融合过程。在线粒体相关内质网膜中发现了一种主要位于线粒体外膜上的GTP酶Mfn,Mfn包括Mfn1和Mfn2两种亚型(Rojo et al.,2002)。内质网膜上的Mfn2与线粒体外膜上的Mfn1或Mfn2凭借蛋白自身的构象可塑性相互缠绕，形成同型或异型的结构复合体，由此构建了内质网与线粒体之间的桥梁(de Brito,Scor‐rano,2008)。位于线粒体外膜上的Mfn1/2与位于线粒体内膜上的另一种线粒体融合GTP酶，视神经萎缩蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)共同介导了线粒体的融合(Cipolat et al.,2004)。
MAM参与调节线粒体的分裂过程。在MAM中发现了Fis1和BAP31的相互作用(Iwasawa et al.,2011)。位于线粒体外膜上的Fis1将主要位于细胞质中的线粒体动力相关蛋白(dynamin-related protein 1,Drp1)募集到线粒体外膜的裂变位点上，Drp1通过寡聚化形成环状结构，然后通过自组装和GTP水解使线粒体膜发生断裂，介导和调节线粒体的分裂过程(Stojanovski et al.,2004)。BAP31是位于内质网膜上的蛋白，可以调控错误折叠的蛋白质的降解和凋亡途径(Wakana et al.,2008)。当Fis1与MAM中的BAP31结合时，细胞凋亡信号被传递至内质网，从而启动细胞凋亡途径(Iwasawa et al.,2011)。
2.2 、参与调节钙信号
内质网和线粒体在细胞钙信号的传递中起着核心作用，其中MAM是钙信号传递的特殊微区。内质网被认为是细胞内钙离子储存的主要区域。肌浆/内质网钙离子ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA)是一种将钙信号从细胞质转运到内质网的蛋白质，并富集于MAM处。SERCA的过度表达使内质网中的钙离子超载，也增加了内质网与线粒体间的钙信号传导，导致线粒体的功能缺陷(Pinton et al.,2001)。跨膜蛋白IP3R可以使钙离子从内质网释放，导致细胞质内钙离子迅速增加，线粒体通过与内质网的密切接触而吸收大量的钙离子。Sig1R也定位于MAM,Sig1R与Bi P形成一个对钙离子敏感的伴侣复合物，可以稳定IP3R的构象，保障内质网与线粒体之间的钙信号可以正常传导(Hayashi,Su,2007)。内质网释放的钙离子通过VDAC通道穿过线粒体外膜，到达线粒体内膜，再通过线粒体单向转运蛋白(mitochondrial calcium uniporter,MCU)复合物使钙信号从线粒体内膜进入到线粒体基质中(De Stefani et al.,2012)。然而，当线粒体基质内的钙离子浓度过高时，会导致线粒体膜通透性转变，使细胞色素c等促凋亡因子被释放到胞浆中，进一步引发细胞凋亡(Bonora et al.,2015)。
2.3、 MAM的其他功能
MAM还参与磷脂代谢与转运、内质网应激反应、线粒体自噬过程等。研究发现MAM中相关蛋白Mfn2、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)等均参与内质网应激的调控(Hernández-Alvarez et al.,2019)。VAPB-PT‐PIP51是MAM上的连接蛋白，通过特异的si RNA干扰其蛋白表达发现MAM结构变得疏松，自噬体形成增多，表明VAPB-PTPIP51可能影响细胞内自噬过程(Gomez-Suaga et al.,2017)。MAM表面富集酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶(Acyl coenzyme A-cholesterol acyltransferase,ACAT),ACAT是细胞内唯一催化游离胆固醇和长链脂肪酸合成胆固醇酯的酶，在体内胆固醇代谢平衡过程中起到关键的调控作用，提示MAM可能是胆固醇与磷脂合成的重要位点(Rusi?ol et al.,1994)。
3 、MAM参与的相关功能对卵母细胞成熟的影响
在MAM参与的相关功能中线粒体动力学及钙信号传递对于卵母细胞的成熟过程至关重要。已有大量研究报道钙离子作为一种内源性信号的信使参与了卵母细胞减数分裂过程的调控，钙信号在卵母细胞阻滞恢复及胞质成熟中不可或缺(Ma‐chaty et al.,2016;Tosti,2006;Orrenius et al.,2003)。线粒体作为细胞的能量中心，卵母细胞发育成熟过程的中心体形成、纺锤体的微管运动、蛋白分子水平的磷酸化及去磷酸化等活动均需要线粒体提供大量的ATP (Sun et al.,2001)。
3.1 、钙信号对卵母细胞成熟的影响
钙离子是一种细胞内广泛存在的信号分子，参与细胞内的信号转导，在细胞的多种生理过程中发挥着重要的作用(Berridge et al.,2000)。越来越多的研究报道钙信号在卵母细胞的成熟过程中也至关重要。Paleos和Powers (1981)发现体外培养液中不添加钙离子虽然不会影响小鼠(Mus musculus)卵母细胞的生发泡破裂(germinal vesicle break‐down,GVBD)过程，但是这种环境下的卵母细胞无法完成第一次减数分裂。此外，还发现在一定的钙离子浓度范围内，随着培养液中钙离子浓度增加，卵母细胞的第一极体排出率也更高。Carroll和Swann (1992)首次报道了小鼠卵母细胞体外成熟过程中存在自发的钙振荡，这种钙离子浓度的波动可能与卵母细胞的胞质成熟有关。Homa (1993)等通过向卵母细胞中显微注射钙信号的激活剂和抑制剂，发现细胞内游离的钙离子作为一种内源性信号的信使参与调控卵母细胞的减数分裂过程。Mehl‐mann (2005)还指出钙离子螯合剂使卵母细胞的减数分裂发生延迟。Liang(2011)等发现在牛(Bos taurus)卵母细胞中，钙离子浓度从生发泡((germinal vesicle,GV)期开始不断增加，在MⅠ期达到最大值，之后下降到相对稳定的水平。钙离子在GV期主要分布在卵母细胞皮质区，在GVBD期仍主要分布于皮质区并趋向细胞中心扩散，MⅠ期逐渐从皮质区转移至染色体区，MⅡ期大量的钙离子聚集于极体中。钙离子浓度的变化调控着卵母细胞生发泡的破裂、第一极体的排出和受精卵母细胞的活化。适当增加钙离子的浓度可以促进处于MⅠ双线期阻滞和MⅡ中期阻滞的卵母细胞从阻滞中恢复，而超出生理范围的钙离子会诱导卵母细胞的凋亡(Machaty,2016;Tosti,2006;Orrenius et al.,2003)。
3.2、 线粒体动力学变化对卵母细胞成熟的影响
在卵母细胞成熟的过程中，线粒体的数量、形态和空间分布都处于动态变化中，这些变化可能是由于卵母细胞发育成熟过程中的中心体形成、纺锤体的微管运动、蛋白分子水平的磷酸化及去磷酸化等活动均需要线粒体提供大量的ATP。在大多数真核细胞中，线粒体沿着微管在细胞内移动，在特定区域发挥功能(Yu et al.,2010)。在GⅤ期，线粒体主要分布于卵母细胞的皮质区，这可能与此时期皮质区的高能量需求有关，卵母细胞在这个阶段需要卵丘细胞支持。GⅤ期卵母细胞的线粒体为圆形，嵴少或呈管泡状嵴。在GVBD期前，线粒体逐渐向卵母细胞核周聚集，一方面可能是为了提供ATP，另一方面可能是为了调节游离钙离子浓度，因为细胞内钙离子浓度的增加是卵母细胞GVBD发生的先决条件。在MⅠ期，线粒体在核周区域继续聚集，这可能与减数分裂的高能量需求有关，如纺锤体组装、染色质凝聚和运动以及极体释放，此时线粒体数量增加，呈长梭形，嵴呈板层状(Sun et al.,2001)。然而，在细胞分裂时，线粒体并不是均匀地分离，而是向卵母细胞定向的纺锤体极移动，这种有利于卵母细胞的不对称遗传保证了母系遗传的线粒体得以保留，为哺乳动物早期发育提供ATP (Dalton,Carroll,2013)。卵母细胞成熟后，线粒体在卵母细胞胞质中均匀分布。线粒体动力学也在卵母细胞成熟过程的细胞器重排中发挥着重要作用。
4 、MAM相关蛋白与卵母细胞成熟
MAM中参与钙信号调节与转运的蛋白质IP3R和VDAC，以及参与线粒体融合与分裂的蛋白质Mfn和Drp1都与卵母细胞的成熟密切相关。其中，IP3R介导钙离子从内质网释放，使细胞质内钙离子迅速增加；VDAC介导钙离子穿越线粒体外膜，到达线粒体内膜。Mfn通过自身构象改变形成复合体从而构建线粒体与内质网间的接触位点，同时在线粒体的融合过程中发挥至关重要的作用；Drp1通过自组装和GTP水解可以使线粒体膜发生断裂，介导和调节线粒体的分裂过程。
4.1、 IP3R与卵母细胞成熟
IP3是由磷脂酶C催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸水解产生的一种重要的细胞内第二信使分子。IP3进入胞质后与内质网膜表面的受体IP3R结合引起构象变化，使钙离子从内质网释放到胞质中，胞质中钙离子浓度升高，从而启动钙信号系统，激发一系列效应(Lee et al.,2006)。IP3R家族由不同基因编码的三个亚型组成，分别是IP3R-1、IP3R-2和IP3R-3 (Joseph et al.,2000)。不同的IP3R亚型对IP3的亲和力不同，其中IP3R-2对IP3的亲和力最高，其次是IP3R-1和IP3R-3 (Tu et al.,2005)。除IP3外，钙离子、ATP和许多蛋白质也可以对IP3诱导的钙离子释放进行变构调节(Hedgepeth et al.,2015)。细胞内钙离子的适度增加增强了IP3R对IP3的结合能力，而过量的钙离子则对IP3R具有抑制作用(Mak et al.,2003)。这些相互制约的机制有助于细胞内钙信号的时空动态调控。
卵母细胞中存在IP3R的三种亚型，但IP3R-1在哺乳动物卵母细胞中的表达量显着高于IP3R-2和IP3R-3(He et al.,1999)。卵母细胞从GⅤ期到MⅡ期的成熟过程中，钙离子释放的敏感性增加。在未成熟的GⅤ卵母细胞中，IP3R-1在整个细胞质中均匀分布。而在卵母细胞成熟过程中，IP3R-1的定位和聚集发生了改变，IP3R-1在质膜周围出现了直径为1～2μm的积聚(Mehlmann et al.,1996)。卵母细胞在成熟过程中，IP3R-1被磷酸化而激活(Zhang et al.,2015),IP3介导细胞内钙离子转运增加，IP3R-1对钙信号的转运能力随着IP3的增加而增强(Ullah et al.,2007)。
4.2 、VDAC与卵母细胞成熟
VDACs的分子质量约为30 k D，在线粒体外膜形成内径约为3 nm的通道，其允许分子质量最大为5 k D的物质通过(Colombini,2012)。真核细胞中的VDAC有三种亚型：VDAC1、VDAC2和VDAC3，分别由各自不同的基因编码。在大多数哺乳动物细胞中，VDAC1和VDAC2的表达具有明显优势，而VDAC3的表达普遍较低，仅在睾丸中高表达(Huang et al.,2014;Sampson et al.,2001)。VDAC1由19个β-折叠形成的桶状结构和1个由N-末端序列形成的α-螺旋组成，α-螺旋移动到通道中心，可以阻断物质的进出，通过调节α-螺旋的移动可以调控孔道的关闭和开启状态(Hiller et al.,2010)。斑马鱼(Danio rerio)的VDAC2显示出类似的19条β链形成桶状结构(Schredelseker et al.,2014)。VDAC1和VDAC2的门控性和选择性在哺乳动物中高度保守(Blachly-Dyson,Forte,2001)。VDACs的磷酸化会增加其传导性。VDACs通过改变构象而开启或关闭孔道可以选择性地运输不同的物质，从而调节线粒体的能量代谢和线粒体与内质网之间的离子转运。
在猪(Sus scrofa)卵母细胞的GⅤ期和MⅡ期都能检测到VDAC1和VDAC2的m RNA。通过免疫荧光技术发现VDAC1定位于猪卵母细胞的质膜和皮质区域周围，VDAC1蛋白在GⅤ期和MⅡ期的卵母细胞中都有明显表达，似乎稳定存在于卵母细胞成熟过程中的减数分裂期间；而VDAC2只在部分GⅤ期卵母细胞的皮质区周围存在，在MⅡ期卵母细胞中没有观察到(Cassaráet al.,2009)。由此可见，VDAC1和VDAC2在卵母细胞中的定位和功能可能并不相同，VDAC2的分布与表达可能与卵母细胞的发育阶段密切相关。VDAC在卵母细胞成熟过程不同时期发挥的不同功能及其作用机制仍待阐明。
4.3、 Mfn与卵母细胞成熟
Mfn1和Mfn2是哺乳动物细胞中线粒体融合的关键调控因子(Santel,Fuller,2001)。Mfn2敲低或敲除使小鼠成纤维细胞中内质网与线粒体之间的连接增加，促进了内质网与线粒体之间的钙离子传导，使细胞对线粒体钙离子过载诱导的凋亡刺激更敏感(Filadi et al.,2015)。Mfn1或Mfn2缺失的小鼠在妊娠中期死亡(Chen,2003)。Zhang等(2016)通过显微注射Mfn2的si RNA阻滞了小鼠的卵母细胞成熟。然而Hou等(2019)发现卵母细胞中Mfn1的敲除导致雌性动物生殖功能缺失，而在卵母细胞中条件性敲除Mfn2对雌性动物的生育能力没有影响，暗示Mfn1和Mfn2在调控雌性生殖中可能发挥着不同的功能。关于Mfn2对卵母细胞成熟影响的研究结果不一致可能是由于试验中采用的基因编辑技术不同(体外敲降和体内敲除)。Mfn2在卵母细胞成熟过程中是否发挥了至关重要的作用仍需进一步阐明。Mfn1敲除的小鼠卵巢中卵泡发育停滞，颗粒细胞的增殖能力降低。卵母细胞和体细胞之间的相互作用不仅是颗粒细胞增殖所必需的(Gilchrist et al.,2008)，也是卵泡发育所必需的(Su et al.,2009)。所以Mfn1缺失可能是通过破坏卵母细胞与周围细胞之间的相互作用，进而抑制颗粒细胞的增殖，最终导致小鼠卵泡不能正常发育(Hou et al.,2019)。
4.4 、Drp1与卵母细胞成熟
线粒体分裂依赖于Drp1，其主要由氨基端GTP酶结构域、中间的螺旋结构域和羧基端GTP酶效应结构域组成(Fr?hlich et al.,2013)。Drp1生理状态下一般定位于细胞浆，在各种线粒体分裂因子刺激作用下，Drp1通过形成螺旋低聚物，可以包裹线粒体外膜并切断外膜，线粒体分裂后，Drp1可重新回到胞浆再被利用(Kalia et al.,2018;Ji et al.,2015)。
卵母细胞中Drp1敲除改变了线粒体在细胞内的分布和形态。正常卵母细胞中线粒体长轴平均长度为0.62 mm，呈较小的圆形，嵴较不发达，均匀分布于细胞质；而Drp1特异性敲除的卵母细胞中线粒体长轴平均长度为1.12 mm，呈长条形，且大小不规则，在细胞质中高度聚集。Drp1缺失使卵母细胞中线粒体与各种膜结构聚集在一起，同时卵母细胞中线粒体严重聚集，导致线粒体的运动受限从而阻碍了卵母细胞的生发泡破裂(Udagawa et al.,2014)。除此之外，Drp1缺失还使卵母细胞中内质网和过氧化物酶体聚集，但内质网积聚这种现象具有一定的细胞特异性，因为敲除小鼠胚胎成纤维细胞和Hela细胞中的Drp1后并没有导致内质网的积聚(Ishihara et al.,2009)。Drp1缺失导致卵母细胞中内质网的钙离子储存量减少，从而影响了卵母细胞中线粒体与内质网的相互作用以及钙信号的传导等。Drp1缺失的未成熟卵母细胞周围有活性的颗粒细胞减少，成熟卵泡标志基因表达减少，而与去除颗粒细胞的正常卵母细胞共培养24 h后，颗粒细胞的活性增加，这一现象表明卵母细胞Drp1缺失会导致卵母细胞分泌颗粒细胞增殖所需物质的功能受损，也因此卵母细胞的成熟受到了抑制(Udagawa et al.,2014)。老年小鼠的卵母细胞中Drp1的表达和磷酸化明显受到抑制，细胞内多种细胞器变形。卵母细胞中Drp1的缺失会影响卵泡的成熟和周围颗粒细胞的增殖，并抑制调节颗粒细胞增殖、卵泡成熟和排卵关键基因的表达，导致排卵不足和女性不育。
5 、总结与展望
MAM相关蛋白IP3R、VDAC、Mfn和Drp1通过调控钙离子浓度和线粒体动力学变化在卵母细胞的成熟过程中发挥着十分重要的作用。卵母细胞中Mfn1的敲除会导致雌性动物生殖功能缺失。而敲除卵母细胞的Drp1会影响卵泡的成熟和周围颗粒细胞的增殖，导致排卵不足和女性不育。近年来关于MAM结构和功能的研究取得了很大进展，MAM相关蛋白在卵母细胞成熟过程中的功能也有了很多报道，但要完全阐明MAM在卵母细胞成熟过程中的功能仍需不断努力。MAM在卵母细胞成熟的不同阶段发挥的具体作用及其作用机制仍处于未知。通过研究MAM对卵母细胞成熟的影响，对深入理解卵母细胞成熟调控机制和应激反应机制提供了理论基础。MAM是鉴定和提高卵母细胞质量及其发育潜能的潜在靶标之一，为提高辅助生殖成功率提供新的思考方向。
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