淡水涡虫隶属于扁形动物门（Platyhelminthes） ,涡虫纲（Turbellaria） ,是动物界最早出现两侧对称、三胚层、营自由爬行生活的动物类群，在动物系统演化中占有重要地位。同时涡虫具有极强的再生能力，即使是小到虫体 1?279 的涡虫组织也能够再生出一个完整的个体[1].当涡虫自耳突后切去头部后，1 周内便能再生出完整的头部，包括功能正常的眼点[2].淡水涡虫由于其眼点结构简单，加上其独特的进化地位和极强的再生能力等特点，已成为研究视觉系统的形成、发育及再生的模式动物。
1. 淡水涡虫的眼点结构
以淡水涡虫的重要代表---日本三角涡虫（Dugesia japonica） 为例，其视觉系统非常明显，一对眼点位于头部背侧两侧，仅由两类细胞构成： 感光细胞和色素细胞，色素细胞形成半月形的视杯，感光细胞位于视杯外侧，其树突向前延伸到视杯内[3],轴突（视神经纤维） 沿着身体背侧中部向后延伸，一部分在腹侧形成视觉中枢，一部分投射到身体对侧形成视交叉以整合双侧光感觉纤维传入的信息[4].
另外，一些肌纤维伸入到视杯内，根据光线的强弱共同调节视杯开口处直径的大小，从而控制光的摄入量[5]（图 1A,1B） .涡虫的眼点由于不含有晶状体等复杂的光折射系统，因此，其功能只能感受到光强而不能成像。尽管如此，它们也和其他高等动物的眼一样，能吸收光能并转化成化学能再进一步转化成电能进而调节其生理活动。涡虫的眼点所具有的这些特征使得它接近于达尔文所提出的“原始眼”[6].它正在成为研究后生动物眼形态发生和进化的模式动物。
2. 涡虫眼点的形态发生过程
在正常成体涡虫体内，其眼点细胞的更新是靠体内多能干细胞（neoblasts） 的分化[8].利用免疫荧光染色技术对于涡虫视觉系统的形态发生过程研究发现，其再生过程可分为 4 个阶段： （1） 自耳突切割后的第 2 天在背部两侧有成团的视觉细胞形成；（2） 第 3 天两侧视神经细胞的轴突横向生长，穿过中线相互连接形成视交叉； （3） 第 5 天另一部分视神经细胞向后纵向生长延伸至脑神经中枢的视觉中心； （4） 第 7 天新形成的视神经细胞聚集形成轴突，形成完整的视觉系统[9]（图 2A,2B） .
3. 涡虫眼点形态发生过程相关基因近几年，借助先进的分子生物学技术，有关涡虫眼点形态发生过程中基因的表达调控研究已取得了较大的进展。目前，在淡水涡虫中已克隆出了大量与视觉系统形态发生相关的调控因子并对其功能进行了研究（表 1） ,从而为研究涡虫视觉系统的形成和发育奠定了坚实的基础。
3. 1 与眼点前体细胞分化相关的基因： 目前发现，在涡虫眼点发育早期表达的基因有 Djsix-1、Djeya、Smednos、Smed-pbx、Smed-ovo 和 Smed-soxB 主要与眼点前体细胞的分化密切相关。Djsix-1 和 Djeya 分别属于 Sine oculis / Six 基因家族和 Eya 基因家族，两者均为比较古老的保守基因。Djsix-1 和 Djeya 在眼点形成的早期共表达并且两者在涡虫眼点形态发生过程中协同作用，共同调控眼点的再生过程[10].通过 RNA 干扰技术（RNAinterference,RNAi） 分别沉默两种基因，导致再生过程中均出现无眼类型。如果把 Djeya 和 Djsix-1 同时沉默，将发育成大量的无眼类型。而且，通过体外结合实验，也发现 Djeya 的保守区域 ED 和 Djsix-1保守区域 SD 高度结合，据此推测，Djeya 和 Djsix-1编码的调控蛋白通过形成紧密结合的二聚体来促进眼点的形成和发育[10].通过实时定量 PCR 技术（quantitative real-time PCR,Real-time PCR） 发现，两种基因在涡虫眼点发育早期高表达并且在再生的整个过程中表达量都比较高，因此认为两者不仅参与了眼点前体细胞的分化，而且在视觉系统功能恢复及维持其正常功能中发挥重要作用[11].目前，Djsix-1 和 Djeya 已成为涡虫眼点形态发生早期标志性基因。最新研究显示，在果蝇眼的发育过程中，Eya 不仅在感光细胞中表达，还调控色素细胞的发育[12],但在涡虫眼点发育中尚未发现其对色素细胞的调控作用。
Smednos 基因属于 Nanos 基因家族，它调控具有锌指结构的 NANOS 蛋白，这种蛋白是高度保守的，其功能主要是促进生殖细胞的分化，同时，nanos基因也参与神经细胞的分化[13].Smednos 基因在涡虫眼点的再生过程和胚胎发育过程中在正在分化的眼点细胞中表达，但是眼点细胞分化完成后不再表达，因此推测 Smednos 基因可能在眼点前体细胞的分化过程中发挥作用[14].
Smed-pbx 基因是在地中海涡虫 （Schmidteamediterranea） 中鉴定出的一种编码包含 PBC 同源域（包含 PBX） 蛋白的基因，RNAi 沉默该基因则涡虫不能再生出眼点，并且发现眼点前体细胞明显减少。因此认为 Smed-pbx 基因在涡虫眼点再生过程中对眼点前体细胞的形成是必需的[15].
Lapan 等[16]通过对涡虫眼点转录组的研究发现，一种保守的转录因子 Ovo 在涡虫眼点形态发生过程中发挥着与 Six-1 和 Eya 基因同等重要的作用。
原位杂交实验表明，在地中海涡虫（S. mediterranea）的眼点再生过程中，Smed-ovo 基因在感光细胞和色素细胞中均表达。头部切割后，Smed-ovo 的表达模式与眼点前体细胞的表达模式相似，而且，几乎所有表达 Ovo 基因的细胞同时表达眼点前体细胞的标记基因 Six-1/2 和 Eya.因此推测，Ovo 基因在眼点前体细胞中表达，调控前体细胞的分化。RNAi 沉默Smed-ovo 导致再生过程中不能形成眼原基及眼点前体细胞。因此认为，Smed-ovo 基因与 Six-1 和 Eya基因一样，在眼点再生过程中发挥着至关重要的作用。同时还发现 Smed-soxB 在感光细胞和眼点前体细胞中均有表达。在干扰 Smed-soxB 的涡虫中发现前部感光细胞明显减少，这表明 Smed-soxB 基因可能具有促进感光细胞分化的功能。
3. 2 与视神经纤维的生长相关基因： 在眼点的发育过程中发现，与视神经纤维生长相关的基因主要有Otx、Djpax6、Djnetrin、Smed-netR、Djslit 和 Smed-roboA,它们主要在眼点形态发生的中期表达。
Otx 基因家族是一个非常庞大的基因家族，其同源基因广泛存在于脊椎动物及无脊椎动物的视觉系统中[17 ~20].在淡水涡虫中，Djotx 是第一个发现的与视觉系统相关的基因。虽然 Gtotx 首次发现在淡水涡虫（Girardia tigrina） 头部再生的胚基中强烈表达，但对其在视觉系统中的功能并未详细阐述[21].随后，在日本三角涡虫（D. japonica） 中发现了 Otx 基因的两个同源基因 DjotxA 和 DjotxB,其中，DjotxB 与 Gtotx 同源性比较高。通过原位杂交发现两者主要在视神经细胞及视神经纤维部位表达，因此推断两者与视神经纤维的生长及光传导作用相关[22].
Pax6 基因属于 Pax 基因家族，在许多脊椎动物和无脊椎动物中 Pax6 基因的表达和视觉系统的发育密切相关，其突变体会导致眼的发育出现严重缺陷或无眼类型[23 ~25].因此，Pax6 被视为动物视觉系统发育中的关键调控基因[26 ~28].然而，在淡水涡虫中，Pax6 基因主要在成体的中枢神经系统（centralnervous system,CNS） 中表达，在再生的眼点中表达水平很低，只能在超微水平检测到其表达。并且，利用 RNAi 技术同时沉默 Pax6A 和 Pax6B 基因，再生的眼点未出现异常[5].利用 Real-time PCR 技术对涡虫眼点再生过程中 Pax6 基因的表达情况进行检测。结果显示，Djpax6 基因的表达水平在涡虫头部再生的第 5 天达到峰值[11],而这个时期是视神经纤维向脑部延伸和眼点功能恢复期[29].因此认为，Djpax6 基因可能与视神经纤维的生长有关，而在眼点发育的早期作用不大[11].
Djnetrin 属于 Netrin 基因家族，在高等动物中，主要是在体内血管形成过程中具有抗血管生成的作用[30,31].在日本三角涡虫中，Djnetrin 在脑背侧中部视交叉部位表达，因此认为它对视神经纤维向脑部延伸过程中具有诱导作用[32].在地中海涡虫（S.mediterranea） 中发现两个 Netrin 基因的同源基因Smed-netrin1 和 Smed-netrin2,它们在成体和再生个体的 CNS 中均有表达，并且在视中心部位也有表达。通过 RNAi 同时沉默 Smed-netrin1 和 Smed-netrin2,结果伸向视中心的视神经纤维变短。因此认为 Smed-netrin1 和 Smed-netrin2 在视神经纤维生长过程中起协同作用[29].另外，Real-time PCR 结果显示，Djnetrin 的表达量在涡虫头部再生过程中逐渐升高，且在切割后的第 4 天有一个明显调高[11],而切割后的第 4 天，也正是视神经纤维生长的时期[33].因此认为，在涡虫眼点再生过程中 Djnetrin的作用主要是促进视神经纤维生长。
Smed-netR （netrin receptor） 属于 Netrin 受体基因家族。在地中海涡虫中，RNAi 沉默 Smed-netR 基因，不仅视神经纤维与脑部视中心的结合出现异常，而且，涡虫的避光反应也发生了改变。因此认为，Smed-netR 基因是视神经纤维向脑部视觉中心正确结合过程所必需的，此外 Smed-netR 基因可能还参与了避光反应的调节[29].
在日本三角涡虫中发现，Djslit 和 DjroboA 基因与视神经交叉的正确形成有关，原位杂交结果显示Djslit 在再生芽基的中心部位表达。 RNAi 沉默Djslit 基因，视神经交叉的形成出现异常； RNAi 沉默DjroboA 后，涡虫视神经交叉的形成也出现异常[9].
同时在地中海涡虫中，RNAi 沉默 Smed-roboA 基因同样会导致视神经纤维生长出现异常现象。因此认为这两个基因在涡虫眼点发育过程中具有指导视神经纤维正确生长的功能[34].
3. 3 与视觉系统功能恢复相关的基因： 在眼点形态发生后期表达的基因主要有 Eye53、1020HH 和Opsin 基因。Eye53 和 1020HH 基因在日本三角涡虫再生的第 5 天表达，RNAi 沉默 Eye53 和 1020HH 基因后，虽然没有观察到涡虫的大脑和视觉神经产生缺陷，但是涡虫却没有恢复避光反应的功能，因此认为Eye53 和 1020HH 基因可能参与了视觉系统功能的恢复 和 维 持[33].Inoue 等[33]还指出，Eye53 和1020HH 基因编码分泌蛋白，这些分泌蛋白可能参与了视神经纤维的正确连接。
Opsin 基因所编码的视蛋白是动物视觉系统中最普遍的感光分子，与生色基团共价结合形成视色素，其功能是将光能转化成电能进而介导视觉形成。对水母 （Tripedalia cystophora） 的最新研究表明，Opsin 在其视觉系统中表达，可能与光感受及图像的形成有关[35].在淡水涡虫中，Opsin 主要在感光细胞胞体中表达[10,36],RNAi 沉默 Gtops 发现涡虫个体失去了避光反应的功能[36 ~38].同时 Real-timePCR 结果显示，在涡虫头部切割后 Djopsin 呈逐渐上调表达趋势，再生第 5 天明显升高，第 14 天达到最高值[11].这种表达趋势和再生个体避光行为的恢复过程相对应，因此，进一步证实 Djopsin 基因在日本三角涡虫的眼点形态发生中的作用是恢复和维持个体的视功能。
3. 4 与眼点视杯的形成相关的基因： 有 Sp6-9、Dlx、Smed-foxQ2、Smed-klf 和 Smed-meis 基因。淡水涡虫的视杯主要是由色素细胞构成，其功能是感受光的方向并参与感光膜的生化反应[39].研究发现，Sp6-9和 Dlx 在再生涡虫的眼点色素细胞中表达，尤其是在视杯前体细胞分化早期表达。RNAi 沉默这两种基因后导致再生过程中不能生成早期的视杯前体细胞，进而不能形成视杯。因此认为，Sp6-9 和Dlx 基因在涡虫再生过程中调控视杯的形成[40].同时，在对涡虫眼点转录组研究时发现，Smed-foxQ2、Smed-klf 和 Smed-meis 基因分别在感光细胞和眼点前体细胞中表达，RNAi 沉默这 3 种基因发现视杯的形状均表现出异常，因此推测，这 3 种基因可能与正常视杯的形成相关[16].
4. 结语及展望
毋庸置疑，涡虫由于其在动物系统演化中的特殊地位、惊人的再生能力和结构简单的“原始眼”,已成为研究后生动物眼的形态发生和进化的模式生物之一。淡水涡虫眼点形态发生过程是一个多基因参与的基因网络协同作用的过程，在这个基因网络中，同一基因在眼点发生过程的不同阶段可能执行着不同的功能，不同基因的作用可能是独立或协同的，从而精确调控着涡虫眼点的形态发生过程（图3） .近年来，随着新的分子研究技术的不断进步，与涡虫眼点发育相关的新基因不断被发现并对其功能的研究逐步深入。尽管如此，关于涡虫眼点的形态发生过程中仍有许多问题亟待解决，如相关基因的调控机制、基因间的关系以及控制涡虫的视觉系统形成的信号通路等，需要更多的学者做进一步深入研究，以期为高等脊椎动物视觉系统形成的机制提供参考。
