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人生长激素的HPLC-IDMS联用高准确度绝对定量方法探析

来源:学术堂 作者:周老师
发布于:2015-09-25 共3312字
摘要

  1 引 言

  人生长激素( Human growth hormone,hGH) 是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的蛋白质,是一种肽类激素,是诊断巨人症、肢端肥大症、遗传性生长激素生成缺陷所致的生长激素缺乏症最常用的指标[1].

  目前,临床检验中针对重组 hGH ( rhGH) 的检测方法有酶联免疫法[2,3]、时间分辨荧光免疫分析法[4]、LC-MS/MS 法[5,6]、毛细管电泳结合紫外和质谱技术[7]也为检测 rhGH 滥用后的浓度的差异提供了新途径。但这些方法都是相对测定法,耗时长、费用高、操作复杂。因此,亟需建立具有操作简单,高准确度和高精密度 hGH 的参考测量方法。

  目前,纯蛋白的定量方法主要有氨基酸分析[8]、质量平衡[9]、定量核磁[10]、质谱法[11]以及同位素稀释质谱法[12,13].氨基酸分析法一般在氨基酸分析仪上通过紫外或荧光检测,因此易受干扰,操作比较复杂; 质量平衡法虽然具有高准确度,但其在标准物质定值方面具有一定的局限性; 定量核磁法具有无需待测物对照品、样品预处理步骤简单、测定快速准确、专属性强、不破坏样品等优点,但灵敏度较低; 同位素稀释质谱法具有操作简单,高准确度和高精密度的特点[13].

  本研究采用快速蛋白液相色谱分离纯化 hGH,再采用 SDS-PAGE 和超高分辨能力 FTICR 对 hGH 进行纯度表征和分子量测定,为蛋白质结构的鉴定奠定基础。采用 KINETEX C18色谱柱在5 min 内快速分离 3 种氨基酸( 脯氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸) .本方法具有操作简易、分析速度快、重现性较好、实用性强等特点,并且准确可靠。以此为基础建立了 hGH 的 HPLC-IDMS 联用高准确度绝对定量方法。

  2 实验部分

  2. 1 仪器、试剂与样品

  Qtrap 5500( 美国 AB 公司) ; Agilent 1200 ( 美国安捷伦公司) ; 垂直电泳槽( 美国伯乐公司) ; AKTApurifier ( 美国 GE 公司) ; 12 T-FTICR 高分辨率质谱仪 ( 美国 Bruker 公司) ; ME235S 型天平 ( 感量0. 01 mg,德国 Satorius 公司) ; RC10-22T 型离心干燥机( 美国 Thermo 公司) ; UFE500 烘箱( 德国 Mem-mert 公司) ; 移液器( 10 ”L,20 “L,100 ”L,200 “L,1000 ”L,法国 Gilson 公司) ; 美国 Milli-Q 超纯水系统。

  标记氨基酸(13C5-脯氨酸、13C5-缬氨酸、13C9-苯丙氨酸,美国剑桥同位素实验室) ; 脯氨酸( GBW( E)100084,Pro) 、缬氨酸( GBW( E) 100055,Val) 、苯丙氨酸( GBW( E) 100061,Phe) 国家标准物质( 中国计量科学研究院) ; hGH( 安徽安科生物工程股份有限公司) ; 三氟乙酸( TFA,中国 DikmaPure 公司) ; 乙腈( 美国 J. T Baker 公司) ; 蛋白质预制胶( 7 × 8 cm,胶厚 1. 0 mm,美国伯乐公司) ; 10 × SDS 缓冲溶液( 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司) ; 彩虹预染宽分子量蛋白 Marker( 10 ~260 kDa,中国中科瑞泰公司) ;其它试剂均为分析纯。实验用水为 Milli-Q 超纯水。

  2. 2 hGH 纯化

  将 1 mg hGH 溶于 1 mL 水中,经 0. 45 μm 滤膜过滤。将 1 mg/mL hGH 溶液,用 AKTA purifierHPLC 系统的 Jupiter C4色谱柱 ( 150 mm × 4. 6 mm,5 μm,Phenomenex,USA) 分离,柱温设为60℃; 流动相 A: H2O ( 含0. 1% TFA) 和流动相 B: CH3CN( 含0. 1% TFA) ,流速为 1 mL / min,紫外检测器波长215 nm,分析时间 30 min,进行梯度洗脱,收集洗脱峰; 收集的洗脱峰浓缩干燥后用 0. 1% 甲酸复溶,进行蛋白质分子量及纯度的鉴定。

  2. 3 hGH 基本性质表征

  2. 3. 1 SDS-PAGE 纯度测定 冷冻干燥后,用洗脱峰收集液鉴定蛋白纯度。分析条件: 在垂直电泳槽内放入蛋白质预制胶,并加入 1 × 电泳缓冲液,使其被充分浸泡。在 1. 5 mL 离心管中以体积比 50∶ 20加入 hGH 样品和上样缓冲液,然后在 100℃水浴锅中煮沸 5 min,取出静置。从!20℃取出 Bio-Rad 双色蛋白 Marker,放至室温,离心待用。在蛋白预制胶的每个孔中上样 10 “L,电泳分析。电泳条件为电压100 V,分离时间为 90 min.分析结束后剥离凝胶用考马斯亮蓝染色 1 h,加脱色液( 水-甲醇-冰醋酸,5∶ 4∶ 1,V / V / V) 过夜脱色。

  2. 3. 2 FTICR-MS 分子量测定 FTICR-MS 配有 12. 0 T 超导磁体和电喷雾离子化源( ESI+) ,检测范围 m/z 200 ~3000.冷冻干燥后的纯化蛋白用 0. 1%甲酸配制 0. 1 mg/mL hGH 溶液,取 500 ”L hGH 溶液,泵流速 10 “L/min,数据采集内存 2 M,256 次扫描,内标质量校正。分子量平行测定 6 次。

  2. 4 HPLC-IDMS 法测定 hGH 蛋白质含量

  2. 4. 1 标准溶液配制 准确称取 10 mg 脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸标准物质( 准确至 0. 00001 g) ,分别溶于 10 mL 1% 甲酸中,配制成标准工作溶液,使用时用 1% 甲酸稀释 10 倍后使用。准确称取 10 mg 同位素标记脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸( 准确至0. 00001 g) ,分别溶于 10 mL 1% 甲酸-水中,配制成标记标准储备液。同时配制脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸含量与样品中脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸含量接近( 约 1∶ 1) 的标准溶液,经 0. 22 ”m 滤膜过滤后,用 HPLC-MS 分析。

  2. 4. 2 hGH 样品的水解 称取 hGH 样品约 10 mg,溶于 10 mL 水中,配成 1 mg /mL hGH 溶液。分别取 200 “L hGH 溶液和标记氨基酸混合标准溶液,加到 2 mL 安瓿瓶中,真空离心干燥 30 min,取出后加入 500 ”L 6 mol/L HCl,通氮 2 min 除氧后密封,在 110℃的烘箱中进行水解,每隔 12 h 涡旋混匀 1 次。水解后用氮气吹干,用 500 “L 0. 1% HCl 复溶,经 0. 22 ”m 滤膜过滤后进行测定。

  2. 4. 3 HPLC-IDMS 分析 采用 KINETEX C18色谱柱 ( 150 mm ×2 mm I. D. ,2. 6 “m; 美国 Phenome-nex 公司) .以 0. 1% TFA-乙腈 ( 90∶ 10,V / V) 等梯度洗脱 5 min,流速 200 ”L / min.质谱仪喷雾电压5. 0 kV; 壳气流速 2 MPa; 辅助气流速 0. 5 MPa; 干燥气温度 550℃ ; 碰撞能力 25.采用多反应检测模式( MRM) ,分别监测如下离子反应对: 脯氨酸: 116->70( Pro) ,121->74( 标记 Pro) ; 缬氨酸: 118->72( Val) ,123->76( 标记 Val) ; 苯丙氨酸: 166->120( Phe) ,175->128( 标记 Phe) .

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