近年来，干细胞移植技术在心肌梗死治疗中的应用越来越广泛。心肌梗死区域的微循环对于移植干细胞的存活、迁移、分化能否有效发挥生物学效应起决定性作用[1].在心肌损伤的早期，微血管数量虽然增多，但不一定能起到再通血流的作用。在心肌梗死干细胞移植治疗前正确评价有效微循环灌注具有重要的意义。本研究旨在探讨实时心肌超声造影（ myocardial contrast echocardiography,MCE） 评价心肌梗死（ MI） 后微循环的应用价值。
1 材料与方法
1. 1 实验动物及分组 21 头中华小型猪，8 月龄大小，体质量（ 27±3） kg,雌雄不限（ 购于新疆医科大学第一附属医院实验动物中心） .随机抽取 3 头作为对照组（ 对照组为假开胸组，仅开胸但不结扎冠状动脉） ,余 18 头为心肌梗死组（ MI 组） ,根据心肌梗死后 1 d、3 d、1 w、2 w、3 w、4 w 时间点随机分为 6组，每组3 头。MI 组和对照组均分别注射超声造影剂，测量参数获得造影剂心肌灌注参数（ A、β、A×β） .
1. 2 实验动物心肌梗死模型的制作及评价
1. 2. 1 心肌梗死模型的建立 参照 Yang 等[2]和Song 等[3]采用的方法，用阿托品、氯胺酮肌肉注射进行诱导麻醉，经耳缘静脉戊巴比妥钠（ 3%） 进行深度麻醉，术中经耳缘静脉注射琥珀酰胆碱、戊巴比妥钠、芬太尼维持麻醉状态，经胸骨左缘第 3、4 肋间打开胸腔，结扎左冠状动脉前降支第 2 对角支以下部分，分层缝合关闭胸腔。手术中始终配备呼吸机、心电监护仪、除颤仪，观测实验动物呼吸、心率、心律和血氧饱和度等指标，如有室颤发生，行直流电复律，必要时行心脏按摩及肾上腺素和碳酸氢钠等药物抢救。
1. 2. 2 心肌梗死模型的建立确认[4]（ 1） 心电图：肢体导联 R 波振幅升高，胸导联 ST 段弓背向上抬高>0. 1 mV,并持续时间>0. 5 h,4 h 后复查心电图，出现病理性 Q 波； （ 2） 血清心肌酶谱检测； （ 3） 超声心动图检查。
1. 3 心肌超声造影检查 使用美国飞利浦公司生产的 iE-33 型超声诊断仪，心脏探头型号 S5-1,频率为 6 MHz.动物麻醉生效后，保持猪侧卧位姿势，根据图像质量适当调节探头角度、增益、聚焦等参数，使心内膜缘显示最佳，调整图像满意后，保持条件不变，经耳缘静脉团注造影剂 1 mL,继以生理盐水 5mL 冲洗。采集胸骨旁乳头肌水平短轴切面，心肌显像稳定后触发闪烁显像，触发高机械指数脉冲发放破坏心肌内造影微泡，随即仪器自动转换为低机械指数实时造影状态，显示心肌内造影微泡再充盈过程，从注射造影剂即刻起全程记录动态影像，直到造影剂廓清为止。超声各参数设置、辐照时间及造影剂注射速度等指标均维持不变。
1. 4 心肌造影图像分析 所有图像均在 Q-Lab 工作站上由 2 位医师双盲法脱机进行 MCE 图像分析。
分别于二尖瓣、乳头肌、心尖段水平进行观察，将感兴趣区（ Region of Interest,ROI） 置于灌注缺损区，软件自动绘制出感兴趣区造影剂再充盈的时间-强度曲线，并根据拟合函数 y=A （ 1-e-βt） 自动计算出平台期强度 A（ 代表心肌血容量） 、再充盈速度 β（ 代表心肌血流速度） ,A×β 可反映心肌血流量。对超声造影剂的所有在体评价指标进行统计学对照分析。
1. 5 微血管密度的检测 超声造影结束后处死实验动物，取心肌组织制作切片，检测血管内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原。组织切片经抗Ⅷ因子染色后，每张切片随机取 5 个 400 倍视野，计算单位视野内Ⅷ因子阳性内皮细胞的平均数，即微血管密度。
1. 6 统计学处理 采用 SPSS17. 0 软件处理数据，多个样本均值比较采用单因素方差分析，组别之间两两比较用 LSD 方法进行分析，以 P <0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 对照组和 MI 组心肌灌注各参数值的比较与对照组比较，MI 组 A、β 和 A×β 灌注参数均有下降，差异具有统计学意义 （ P <0. 05） ; MI 1 w 组在心肌梗死后各项灌注参数指标最高，心肌梗死后2 w、3w 和 4 w 组灌注参数指标均较 1 w 组下降，差异有统计学意义 （ P <0. 05） ,2 w 与3 w 组各项灌注参数指标相比差异无统计学意义 （ P >0. 05） ; 4 w组各项灌注参数指标较 2 w、3 w 组下降明显，但差异无统计学意义（ 表 1） .【1】
2. 2 心肌梗死后不同时间点微血管数量的比较心肌梗死后 1 d 组和 3 d 组微血管的数量无明显差别 （ P >0. 05） ,MI 1 w 组的微血管数量增多，与 3 d组相比差异有统计学意义 （ P <0. 05） ,2 w 组与 3 w组微血管数量无明显差异 （ P >0. 05） ,MI 4 w 组微血管数量较 2 w、3 w 组减少，差异有统计学意义 （ P<0. 05） （ 图 1、2） .【2】
2. 3 微血管密度与心肌造影灌注强度的关系 心肌造影灌注强度与病理检测的微血管密度存在正相关关系。Y（ 微血管密度） = 1. 098 + 0. 757 6 X（ 心肌造影灌注强度） ,相关系数r =0. 852,r2= 0. 752 （ P <0. 05） .
3 讨论
目前干细胞移植治疗心肌梗死的有效性已得到基础实验和临床试验的证实[5],但存在移植细胞存活率低的问题，移植区域新生环境的微循环对干细胞移植成功起着关键作用。微血管密度（ MVD） 检测被认为是评价微血管新生的可靠指标[6],但此方法不适用于临床在体评价。长期以来，临床医生无法准确地定量被移植区域内的有效微循环。实时心肌超声造影（ MCE） 通过观察造影剂在心肌内的动态充盈过程，可直观地显示低灌注及无灌注区域的部位及范围 ,从而达到评价心肌梗死后有效微循环的目的[7-8].在实时心肌超声造影过程中，微泡运输是通过心肌组织的微循环，引起心肌组织背反射的瞬间升高，从而成功地用于判断心肌缺血和坏死。
本研究在动物模型中用放射标记微粒的实验证实，时间对比背反射结果的数据与心肌血流量测量存在相关性。进一步表明，微泡的区域性分布与心肌血流量的区域性分布有关。
Jivraj 等[9]的研究显示，大鼠心肌梗死后 1 w,梗死边缘微血管增生明显，密度最大，是对心肌梗死急性期的反应性变化。心梗后 2 ~3 w,随着心肌梗死区域的恢复，微血管结构重新调整，一部分微血管消失，保留的微血管增粗再通。心梗后 4 w 心肌瘢痕形成，心肌硬化增加，微血管不易继续长入[10].本研究结果显示造影剂心肌灌注参数（ A 值、β 值、A×β 值） 和微血管密度均在心肌梗死后 1 d 开始升高，1 w 达到峰值，之后开始下降，与病理结果相吻合。而且各参数之间有一定的相关关系。另外通过超声造影剂的灌注参数可以计算出微血管数量，因此今后有望用超声造影剂心肌灌注参数在体无创评估微血管数量，为治疗缺血性心脏病探索一种新的无创的方法。
参考文献：
[1] Wang Y,Hu X,Xie X,et al. Effects of mesenchymal stem cellson matrix metalloproteinase synthesis in cardiac fibroblasts [J].Exp Biol Med,2011,236 （ 10） : 1197-1204.
[2] Yang CH,Sheu JJ,Tsai TH,et al. Effect of tacrolimus on myocar-dial infarction is associated with inflammation,ROS,MAP kinaseand Akt pathways in mini-pigs [J]. J Atheroscler Thromb,2013,20（ 1） : 9-22.
[3] Song GX,Li XR,Zhang FX,et al. The occurrences of ventriculararrhythmia after acute myocardial infarction in a porcine model:comparison between ligation and occlusion[J]. Chin J Cardiac PacElectrophysiol,2012,26（ 3） : 246-249.
[4] Lichtenauer M,Schreiber C,Jung C,et al. Myocardial infarct sizemeasurement using geometric angle calculation[J]. Eur J Clin In-vest,2014,44 （ 2） : 160-167.
