对氧磷酯酶(Paraoxonase,PON)是一类钙依赖性的催化水解磷酸酯键的芳香酯酶,因其常见底物为对氧磷而命名。其包括PON1、PON2和PON3三种亚型,其中PON1主要由肝脏合成分泌入血、高亲和结合于高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL),是HDL发挥抗氧化及抗炎的主要成分。
大量流行病学调查表明,人群中可因PON1基因多态性、衰老、冠心病、糖尿病、代谢综合征等代谢性疾病因素出现血清PON1活性降低,我们前期的调研也认为,血清低PON1活性可作为评估冠心病事件发生及严重程度的一种危险标志。一系列实验研究 也 证 实,PON1具 有 抗 动 脉 粥 样 硬 化 的 作用:PON1基 因 敲 除 (PON1 gene knockout,PON1-/-)小鼠可观察到体内HDL更容易氧化,低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)氧化明显增加,高脂条件下更易导致动脉粥样斑块形成;在apoE基因敲除小鼠中高表达PON1,HDL抗氧化能力增强,可有效减缓粥样斑块的发展;细胞实验也发现,PON1转基因或高表达可降低巨噬细胞过氧化物水 平,显 着 抑 制 炎 症 因 子 肿 瘤 坏 死 因 子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的合成和分泌,明显改善巨噬细胞的炎症氧化状态。尽管PON1确切的作用底物及相关机制仍未彻底阐明,但其抗炎抗氧化活性显然对于抗动脉粥样硬化效应有重要意义。
因此,本研究拟构建含人源性PON1基因的慢病毒载体,旨在真核细胞高效表达分泌PON1,为进一步研究PON1的生理性底物、相关代谢性疾病的发生机制及临床诊治奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂人胚肾上皮293T细胞购于武汉大学典型培养物保藏中心;pWPI-GFP慢病毒表达载体受赠于美国South Carolina大学医学院樊大平博士;来源于人肝cDNA文库含PON1的pUC载体购于Genecopoeia公司;质粒提取试剂盒购于TIANGEN公司;LB培养基为OXOID公司产品;PCR相关试剂为Takara公司产品;DNA凝胶纯化回收试剂盒购于Axygen公司;DMEM培养基、胎牛血清、小牛血清购自Gibco公司;对氧磷 (paraox-on)、巯基乙酸盐肉汤(thioglycollate broth)为Sigma公 司 试 剂;LDL购 于ProSpec-Tany公 司;蛋 白Marker、核酸Marker、磷酸钙转染试剂盒源于Pro-mega公司;RIPA裂解液购于碧云天生物技术研究所;PON1抗体、羊抗小鼠IgG为Abcam公司产品;ECL化学显影液购于Thermo公司;TNF-α、IL-6的酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购于eBioscience公司;其它试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 pWPI-PON1重组载体的构建根据慢病毒载体图谱及购买的pUC19质粒中PON1序列,设计定点突变PCR的特异寡核苷酸引物,即于目的基因的5′端 添 加 上PmeⅠ酶 切 位 点,上 游 引 物5′-TACGTTTAAACTCCCCGACCATGGCGAAG-3′,下游 引 物5′-GGCGGCGTTTAAACTTAGAG CT-CACA GTAA-3′(下划线标记处为Pme Ⅰ酶切位点),引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。
PCR扩增长度为1 068bp。PCR条件(95 ℃变性,55 ℃退火,72℃延伸)PCR反应后,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像系统观察DNA条带位置。
用限制性内切酶PmeⅠ分别对PON1扩增产物及pWPI-GFP慢病毒载体进行酶切(37 ℃水浴4h),并将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离,采用凝胶纯化回收试剂盒纯化酶切产物,进而在T4连接酶作用下于16℃连接过夜。次日,连接液转化感受态细 菌DH5α,铺 于 含 氨 苄 青 霉 素 (ampicillin,Amp)的LB培养平板上过夜培养,第2天可挑取单菌落接种于小量含Amp的LB液体培养基中,振摇过夜,收集菌体进行质粒小量提取及琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子;纯化重组质粒送上海桑尼生物科技有限公司进行DNA测序,确证插入目的序列的正确方向,无碱基突变。
1.2.2 pWPI-PON1重组载体转染293T细胞将对数生长期的293T细胞接种于直径10cm的细胞培养皿,给予10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、5% CO2培养箱内培养,待密度至40%-50%且细胞生长状态良好时进行转染,转染前2h细胞换液(全培养基)。在两个无菌圆底试管中分别用500μl溶液准备预混的磷酸钙转染体系:管1含20μg DNA、62μl 2mol/L CaCl2;管2为2×HEPES缓冲液(pH 7.1),将管1溶液逐滴加入管2并涡旋震荡,室温孵育20min后,逐滴加入293T细胞培养板并混匀,12h后更换新的10%胎牛血清的DMEM培养液,分别于0,12,24,36,48及60h时间点用倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况,并收取0.2ml培养基,用于测培养基中PON1含量和活性。
1.2.3 Western blotting检测培养基中PON1的含量不同时间点收集的培养基加5×凝胶上样缓冲液处理,取35μl进行10% SDS-PAGE分离,将凝胶中 蛋 白 电 转 移 至 硝 酸 纤 维 素 膜,再 依 次 进 行PON1一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜及ECL化学发光法显影,以凝胶成像系统扫描分析,检测样品中目标蛋白的相对含量。
1.2.4 PON1活性测定将转染后不同时间点收取的细胞培养液,按本室建立的方法测定PON1活性,即:采用酶水解底物对氧磷为对硝基酚的原理,以100 mmol/L Tris-Cl缓冲液(pH 8.5)建立200μl的分析体系:含50μl样品、1.2mmol/L对氧磷、2mmol/L CaCl2、2mol/L NaCl,于25 ℃下,利用酶标仪(Eon,Biotek公司)在405nm处连续扫描记录4min内产物生成速率。以每升血清(培养基)每分钟生成产物对硝基酚的微摩尔数[μmol/(min·L)]表示1个PON1酶活性单位值(用kU/L表示单位)。
1.2.5 小鼠腹腔原代巨噬细胞的培养与氧化模型小鼠腹腔巨噬细胞取材于C57BL/6小鼠(购于武汉大学A3动物中心),实验前于小鼠腹腔内注射3%巯基乙酸盐肉汤3ml,第4天将小鼠安乐死,收集腹腔PBS灌洗液,调整细胞数以1×106/孔铺于6孔细胞板,以10%小牛血清的DMEM培养液进行原代细胞培养,24h后换为1ml新鲜无血清高糖DMEM培养基,同时加入2ml慢病毒载体瞬时转染293T细胞48h的培养基,氧化组以10mg/L氧化 型LDL(oxidative LDL,ox-LDL)[10μmol/LCu2+与LDL 1g/L,37℃共孵育24h,0.2mmol/LETDA(pH 7.4)终止反应,透析,0.45μm过滤获得]
处理细胞建立氧化条件,细胞置于37 ℃、5% CO2温箱继续孵育,收集6h时各孔的条件培养液及RIPA裂解液处理的细胞,留做炎症因子的检测分析。
1.2.6 ELISA法检测TNF-α、IL-6的水平培养基中TNF-α、IL-6水平的检测采用ELISA法按试剂盒说明进行,于酶标仪450nm处测量,每个样本重复3次。每孔细胞以Lowry法测定RIPA裂解液蛋白含量,细胞分泌入培养基中TNF-α、IL-6的含量以单位细胞蛋白量的TNF-α、IL-6水平(ng/g细胞蛋白)表示。
1.2.7 统计学分析实验结果以x珔±s表示,采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析,两组间均数比较采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 pWPI-PON1重组慢病毒载体构建与鉴定利用引物 设 计、PCR法 获 得 两 端 添 加 酶 切 位 点 的PON1基因,PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中可见约1kb处有明亮的DNA条带,与预期PON1条带基本一致(图1A)。
将纯化的PCR扩增产物与pWPI载体经酶切连接、转化后,筛选单菌落进行液体培养、提取质粒,经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定大小后送检测序,测序结果证实第1、2号为构建成功的pWPI-PON1重组载体(图1B)。
2.2 pWPI-PON1重组体瞬时高效转染以pWPI-GFP空载体为对照,利用磷酸钙转染法将pWPI-PON1重组体转入293T细胞,转染换液后于0,12,24,36,48,60h不同时间点在荧光显微镜下观察转染效率,可见慢病毒的高效转染率(细胞GFP荧光阳性率可达到80%-90%),且随时间延长,GFP蛋白表达量持续增高(图2)。
2.3 转染后培养基中PON1的含量与活性转染后不同时间点收取细胞培养基,Western blotting检测结果显示,与pWPI-GFP转染对照组比较,pWPI-PON1转染组可高表达PON1并分泌入培养基中,PON1含 量 在60 h内 呈 时 间 依 赖 性 递 增 趋 势(图3)。同时采用对氧磷为底物检测PON1活性,pWPI-GFP转染组的细胞培养基中几乎无PON1活性,而pWPI-PON1转染组培养基中PON1活性随时间递增而升高,且在48h可达最高(图4)。
2.4 培养基中PON1对巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6的影响采用ELISA法检测PON1孵育对巨噬细胞分泌炎症因子TNF-α、IL-6的影响,结果显示(图5),与基础对照组相比,含PON1(活性为8.3kU/L)的培养基与巨噬细胞共孵育6h时,细胞分泌TNF-α、IL-6的水平明显降低P<0.01);在ox-LDL作用下,细胞分泌TNF-α、IL-6的水平显着上升,而加入含PON1的培养基共孵育,可使细胞TNF-α、IL-6炎症因子水平降低,差异有显着性(P<0.01)。3讨论HDL是公认的体内抗动脉粥样硬化的保护因子,PON1作为HDL特异结合的抗氧化酶成分,已发现其酯酶活性能作用多种底物,如水解LDL的氧化磷脂和血小板活化因子等,可抑制LDL的氧化修饰,纯化的PON1可独立抑制TNF-α诱导的细胞黏附因子1的表达,此作用也可以与HDL结合而加强,故PON1的存在及其抗氧化抗炎活性对于HDL的完整性与功能不可缺少,其在动脉粥样硬化的发生发展中可能扮演重要角色。
前期有研究利用PON1转基因鼠来源的巨噬细胞,证实细胞内高表达PON1可发挥其抗氧化抗炎而对动脉粥样硬化有明显防御作用。但小鼠腹腔巨噬细胞或骨髓来源的巨噬细胞几乎不表达PON1。
PON1主要从肝脏合成后分泌入血,因此,为更好阐明循环中PON1对巨噬细胞的影响,我们选择了慢病毒表达系统,此类重组逆转录病毒经不断完善,可使外源基因长效、稳定表达外源蛋白,有利于代谢性疾病等慢性病研究中的长效动物实验,已成为基因功能研究和临床治疗最有应用前景的生物工具。本实验中利用重组慢病毒载体转染真核293T细胞,获得了持续高活性PON1的表达分泌,进一步与小鼠腹腔原代巨噬细胞共孵育,模拟了细胞外环境中PON1的作用方式,从而观察到外源PON1显着降低细胞炎症,使其产生TNF-α、IL-6的水平明显减少。有研究报道,PON1的抗炎作用可通过促使巨噬细胞清道夫受体BI(SRBI)的高表达,抑制TLR-4活化,下调NF-κB介导的炎症活化通路;也可能发挥抗凋亡而保护巨噬细胞。另有实验证明,PON1可通过直接减少炎症刺激引起的ROS水平,增强HDL抗炎活性。
本实验中采用荧光显微镜观察到磷酸钙转染法可获得外源蛋白的持续增加,培养基中PON1的活性也随着升高,说明慢病毒载体对细胞的毒性影响并不显着。对于60h内,荧光强度和蛋白表达均随时间而增加,而培养基PON1活性仅在48h时达最高,之后至60h时,活性有所下降,分析此原因,由于细胞转染60h后一直未换液,细胞代谢产物的积聚可能是导致PON1活性减低的因素,这也从一个侧面反映PON1酶活性可受环境、药物等多因素的调节。因此如何获得高含量及相应活性的PON1,为后续PON1的作用机制及对疾病干预的研究提供重要信息。
利用慢病毒载体系统表达分泌人的PON1蛋白,为我们深入研究PON1的生理功能、对相关疾病的诊疗价值提供了多层次、多方位的研究手段,奠定了实验基础。
