水稻稻瘟病是世界性的重要真菌病害,病害流行的年份严重影响水稻产量和稻米品质,在很多重病区甚至颗粒无收。选育和利用抗病水稻品种是防治稻瘟病的最有效措施,但稻瘟病菌生理小种不断变化且变异较快,育成的抗病水稻品种通常种植数年后极易丧失抗性。水稻品种丧失抗病性的主要原因是稻瘟病菌生理小种的变化以及新生理小种的出现和积累,因此,了解田间稻瘟病菌生理小种的变化动态和潜在致病小种的发展趋势,是水稻抗瘟性品种选育、新品种推广、品种合理布局和稻瘟病防治的重要课题,也是水稻病害可持续控制的长期任务。
水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)生理小种监测是一项十分重要的工作,现在以多点、多面、多寄主地采样分离单孢菌株测定其小种类型,可准确反映某一地区总体稻瘟病菌生理小种组成与分布情况,但这种方法工作量较大且费时费力。本试验从江西省井冈山稻瘟病抗性鉴定基地种植的不含已知抗瘟基因品种丽江新团黑谷(Lijiangxintuan-heigu,LTH)稻瘟病菌标本中分离单孢菌株,利用7个中国传统鉴别品种和30个单基因抗瘟品系分别测定稻瘟病菌致病性分化情况及其无毒基因,并与这一地区多点不同品种标本分离的稻瘟病菌致病性分化情况进行比较,旨在明确LTH稻瘟病菌群体构成与当地整体稻瘟病菌群体的相关性,为监测稻瘟病菌生理小种和鉴定品种抗性基因的研究提供新途径。
1、材料与方法
1.1供试材料
供试菌株:从江西省井冈山稻瘟病抗性鉴定基地种植的LTH采集分离的100个有效单孢菌株和从其他20个水稻品种上分离的200个单孢菌株。供试品种:中国农业科学院作物栽培研究所育成的6个水稻抗稻瘟病近等基因系和国际水稻研究所与日本合作育成的24个水稻抗稻瘟病单基因系(表1);7个中国鉴别寄主特特勃、珍龙13、四丰43、东农363、关东51、合江18和LTH均由广东省农业科学院朱小源博士惠赠。
1.2接种孢子液的制备
单孢菌株在含PDA培养基试管里培养7~10d后转接到玉米粉稻秆琼脂培养基上扩大培养7~9d,然后在黑光灯下光照培养3~4d。用无菌水冲洗孢子,将接种孢子液浓度调至1×105个/mL备用。菌株培养及产孢均在25℃下进行。
1.3致病性的测定
水稻种子催芽后穴播于长35cm、宽30cm、高5cm的塑料育秧盘里(50个孔),每盘播37份材料,每份材料播种量为8~10粒。采用旱育秧,待秧苗长至2叶1心期,每盘施尿素0.5g,接种前共施3次。待秧苗长至3.5~4.0叶龄,用制备的孢子液进行人工喷雾接种,接种菌液量为每盘40mL。接种前在孢子悬浮液中加入0.1%吐温20,接种后将秧苗置于培养箱中暗培养,在25℃下保湿24h。
之后置于温室,在25~28℃下保湿至秧苗发病,接种7d后进行抗性测定。每个菌株的致病性测定均设2个重复。病级调查按国际水稻研究所稻瘟病圃苗瘟分级标准进行,1~3级为抗病、4~9级为感病,并按照中国稻瘟病菌生理小种联合试验组提出的方法划分稻瘟病菌生理小种。
1.4致病率与毒力频率的计算
致病性测定参照杨秀娟等的方法进行,单个菌株对所有测试水稻品种(基因)的致病率(patho-genicfrequency,PF)=(感病的水稻品种数/所有测试水稻品种数)×100%,其中PF≥70%为强致病力,50%≤PF≤69%为较强致病力,29%≤PF≤49%为中等致病力,PF<30%为弱致病力。
稻瘟病菌无毒基因的出现频率(occurancefre-quency,OF)=(出现某个无毒基因的菌株数/总菌株数)×100%。
2、结果与分析
2.1同一寄主稻瘟病单孢菌的生理小种利用
7个中国传统鉴别品种和30个近等单基因系抗瘟品种,对100个从LTH稻瘟病菌标本中分离的单孢菌株分别测定生理小种和致病力。试验结果表明,测试菌株可分为3个种群11个小种,其中ZA占85.00%,ZB占13.00%,ZC占2.00%(图1)。
来源于寄主品种LTH稻瘟病菌致病性测定结果表明,所有菌株的毒力频率为63.33%~96.67%(表2)。ZA种群包括ZA1(69%)、ZA5(8%)、ZA7(1%)、ZA11(2%)、ZA13(2%)、ZA15(3%),ZB种群包括ZB1(4%)、ZB13(7%)、ZB15(2%),ZC种群包括ZC1(1%)、ZC13(1%)。100个单孢菌株中对30个单基因抗病品种的毒力频率最高为100%,最低为63.33%,平均83.33%,其中毒力频率在60%以下、60%~80%、80%~100%所占比例分别为0、39%、61%。
分析结果表明,从同一品种病标样中分离的稻瘟病单孢菌株包含有不同的生理小种种群和生理小种,但其中某一种群和某一生理小种占绝对优势,如ZA种群菌株数占85%,而ZA1小种菌株数占69%。分离的单孢菌株的致病力也有差异,对30个单基因抗病品种的毒力频率范围为63.33%~100%。测定结果显示,分离出的100个单孢菌株都是中等致病力和强致病力菌株,分别占39%和61%,且未测得弱致病力菌株。
2.2同一地区LTH与其他品种稻瘟病菌的致病性
从LTH稻瘟病菌标本中分离的100个单孢菌株可划分为ZA、ZB、ZC3个种群;同一地区种植的其他20个水稻品种标本分离的200个稻瘟病单孢菌株可划分为ZA、ZB、ZC、ZD4个种群,优势小种为ZA1(32.69%)、ZB13(15.38%)、ZB15(7.69%),对30个抗瘟单基因系的平均致病频率为78.01%(表3)。
测定结果显示,不含任何抗瘟基因品种LTH的稻瘟病菌致病性分化,包括生理小种组成、优势小种构成及出现频率、致病力强弱等与同一地区总体稻瘟病菌致病性的分化高度相符。
2.3同一寄主稻瘟病单孢菌无毒基因的测定利用
30个已知抗瘟基因的单基因系抗病品种接种从LTH稻瘟病菌标本中分离的100个稻瘟病单孢菌,根据Flor的基因对基因学说,由鉴定品种的抗感反应推导出所接种稻瘟病菌所含的无毒基因(表4)。
由表4可知,除Avr-a(2)外,其余29个无毒基因均有出现,其中Avr-k、Avr-zt、Avr-z5、Avr-1(1)、Avr-k与Avr-k(C)等6个无毒基因在出现频率都高于50%,说明与之相对应的抗瘟基因的水稻品种在该地区可以应用。
3、讨论
稻瘟病的普遍发生,给水稻生产造成极大危害。
为了减少稻瘟病造成的损失,越来越多的研究者不断采用不同的鉴别品种进行生理小种的研究和监测。了解生理小种的类型分布和变异规律,尤其是优势生理小种的动态变化和致病性变异趋势,掌握当地生理小种对单基因品种的致病性,对抗病品种的合理利用和抗性基因的有效挖掘有重要意义。
本试验选用不含已知抗瘟基因的水稻品种丽江新团黑谷(LTH)作为稻瘟病寄主品种分离稻瘟病菌进行生理小种测定,分离到的100个稻瘟病单孢菌株可划为ZA、ZB、ZC3个种群,出现频率分别为85.00%、13.00%、2.00%,优势小种分别为ZA1(69%)、ZA5(8%)、ZB13(7%),对30个抗瘟单基因系的平均致病频率为83.03%;同时在同一地区种植的其他20个水稻品种标本分离的200个稻瘟病单孢菌株可划分为ZA、ZB、ZC、ZD4个种群,优势小种为ZA1(32.69%)、ZB13(15.38%)、ZB15(7.69%),对30个抗瘟单基因系的平均致病频率为78.01%。试验结果表明,从LTH分离的稻瘟病菌种群与当地总体稻瘟病菌的种群构成和致病力十分相近,因此,可以在某一地区LTH稻瘟病菌标本上分离单孢菌株来测定该地区的稻瘟病菌生理小种。
了解这一地区的稻瘟病菌生理小种类型分布和变异规律,可以减少从众多寄主品种上分离稻瘟病菌来测定这一地区的稻瘟病菌小种类型,从而节省大量人力物力。今后将继续在多点多年份采集稻瘟病菌标本,以进一步验证此结果。
掌握一个地区稻瘟病菌的种群动态和优势小种,获得有价值的抗病基因信息和材料,有利于育种专家采用分子标记等方法选育抗病品种,因此,生理小种的研究热点将会从鉴定小种型向生理小种包含的无毒基因转变,对生理小种的分布研究也将转化为无毒基因的分布研究。本试验在30个抗瘟单基因品系上,接种来自LTH的稻瘟病菌,通过抗感反应结果,依据Flor的基因对基因学说,推导接种稻瘟病菌所含的无毒基因。结果显示:在100个稻瘟病菌株中共出现29个与供试抗瘟单基因品系所对应的无毒基因,其中Avr-k、Avr-zt、Avr-z5、Avr-1(1)、Avr-k与Avr-k(C)等6个无毒基因出现频率都高于50%,说明与之相对应的抗瘟基因在该地区的抗病育种中有重要的应用价值;Avr-a(2)没有在所接种的菌株出现,因此,所含与之对应的抗瘟基因品种应当在该地区慎用。
LTH是一种不含已知抗瘟基因的水稻品种,在理论上可以侵染它的稻瘟病菌很多,因此,从LTH稻瘟病菌标本上分离单孢菌株来测定某一地区的稻瘟病菌生理小种构成与动态变化具有一定的代表性和可信性,这在本试验结果中已得到初步验证。利用30个抗瘟单基因品系接种从LTH上分离到的稻瘟病菌,可以了解该地区稻瘟病菌的致病力强弱和所含无毒基因等信息,故加强从LTH分离稻瘟病菌的致病性分化研究,对当地稻瘟病的防控具有重要意义。
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