甘蔗(Saccharum of ficinarumL.)是重要的糖料作物和有发展潜力的可再生能源作物。中国现已发展成为仅次于巴西、印度的世界第三大甘蔗糖生产大国,每年甘蔗种植面积超过130万hm2,甘蔗糖年产量约1300万t,占中国年食糖总产量的90%以上。
甘蔗黑穗病(sugarcane smut disease)又称甘蔗鞭黑穗病、甘蔗黑粉病和甘蔗灰包病,是一种气传真菌病害,由甘蔗鞭黑粉菌(Ustilago scitaminea Sydow)引起,该病原菌隶属担子菌亚门黑粉菌目黑粉菌科的黑粉菌属。自1877年在南非纳塔尔首先报道甘蔗黑穗病以来,该病害现已成为世界范围内广泛流行的重要甘蔗病害。甘蔗黑穗病也是中国蔗区最严重的甘蔗病害,目前的甘蔗主栽品种均能普遍感染黑穗病,且田间发病率较高,经济损失十分严重。
抗病育种是防治甘蔗黑穗病最经济最有效的措施,世界主要甘蔗糖业生产大国(美国、巴西、印度、古巴、澳大利亚、中国等)都将甘蔗对黑穗病的抗性作为品种选育的一个主要指标。沈万宽等采用人工浸渍接种法,对近年从澳大利亚引进的甘蔗品种进行黑穗病抗性鉴定,从中筛选出Q200B、Q190、Q171等抗性水平为抗病的品种;王维赞等采用人工浸渍接种与自然感染相结合的方法,对从国内外引进的14个甘蔗品种进行黑穗病抗性鉴定,筛选出台糖88/99和台糖89/1626两个高抗黑穗病品种。笔者采用人工浸渍接种与田间自然感染相结合的方法,对34个甘蔗品种(品系)进行黑穗病抗性鉴定与评价,旨在为甘蔗新品种选育和推广应用以及亲本评价提供科学依据。
1、材料与方法
1.1供试品种(品系)
供试甘蔗品种(品系):98-73、00-319、01-121、01-120、00-256、01-246、粤糖95-168、01-160、粤糖96-86、粤糖03-233、粤糖91-1102、01-125、01-244、粤糖00-318、99-57、01-79、粤糖99-66、粤糖91-976、ROC22、CP93-1634、CP89-2143、CP94-1100、ROC10、97-639、粤农83-88、ROC20、粤糖03-373、粤糖03-393、粤糖02-305、粤糖02-373、粤糖04-232、NCo310、NCo376、F134等34个,均来自广州甘蔗糖业研究所保育基地。
1.2病菌冬孢子的采集与保存
于试验当年(2004-2012年)的5月中下旬,分别从广东省甘蔗主要产区遂溪、雷州、徐闻、翁源等地的ROC22、ROC16、ROC25及粤糖89-113等主栽品种上采集新鲜黑穗病鞭子(冬孢子),于室温自然风干4~5d,用毛笔轻轻刮下各鞭子上的冬孢子,并将冬孢子充分混匀后分装于小滤纸袋中(每袋10g),保存于4℃冰箱中备用。
1.3病菌活性的检测
取微量待测的甘蔗黑穗病菌混合冬孢子,用无菌水混匀,经YEPS培养基平板培养2~3d(28℃)后检测冬孢子的菌丝生长状况;另取微量混合冬孢子,经1%水琼脂培养(含50μg/mL氨苄青霉素)后镜检冬孢子的萌芽率。
1.4接种、种植与发病调查
1)接种。采用浸种法进行人工接种。用检验合格的冬孢子配制5×106个/mL的孢子悬浮液(2g干燥冬孢子兑水1L),将种芽(每品种60个新鲜单芽)置于孢子悬浮液中浸泡30min,取出放入塑料袋内封口,经过保湿催芽24h后种植。
2)种植。接种材料种植于广州甘蔗糖业研究所试验基地h或华南农业大学广州增城教学科研基地,小区单行(行长3m)、不完全随机区组排列、重复3次,每行(区)种植20个接种单芽,植后覆盖薄土,其余田间管理按常规大田生产操作。
3)调查。种植后发现有黑穗病株时进行第一次调查(约植后30~40d),以后每隔7d调查1次,连续调查6个月后终止。每次调查发现病株时,记载后将其连根拔除,以免重复记载发病株数。在调查终期,合计发病株数及总株数,计算其株发病率。
1.5田间自然感染黑穗病发生率调查
在田间甘蔗黑穗病发病高峰期(5-6月),选取代表性的田块,连续调查50株甘蔗植株的黑穗病发生株数(含早期症状),计算各品种的病株发生率。
1.6甘蔗黑穗病抗性分级标准
采用1~9级分级标准进行抗性分级,按照国家甘蔗育种“九五”攻关指标,以每丛发病株率评价供试品种的抗病性。
2、结果与分析
2.1甘蔗黑穗病菌冬孢子的活性检测
在显微镜下观察采集的甘蔗黑穗病菌冬孢子,可见近圆形、棕褐色厚垣孢子(图1-A);厚垣孢子为休眠孢子,在YEPS培养基或1%琼脂糖上均可萌芽(图1-B),产生具有致病力的白色羊毛状双核菌丝体(图1-C)。检测结果显示冬孢子的萌芽率超过90%,表明用于接种的甘蔗黑穗病菌冬孢子活性较好,达到接种要求。
2.2甘蔗黑穗病发病潜伏期及株发病率
从病原菌侵入至出现病害症状的这段时间称为病害发病潜伏期。病害发病潜伏期是评价寄主对入侵病原菌防御能力的一个指标。由表1可知,所有供试甘蔗品种(品系)的黑穗病发病潜伏期为28~140d。发病潜伏期小于60d的有5个甘蔗品种(品系),占供试品种的12.8%;发病潜伏期60~100d的有19个甘蔗品种(品系),占48.7%;发病潜伏期101~140d的有10个甘蔗品种(品系),占25.6%。
这表明人工接种后大都数甘蔗品种或品系的黑穗病发病潜伏期为60~100d。从表1还可以看出,供试甘蔗品种(品系)的黑穗病株发病率介于0~88.4%,黑穗病发病潜伏期较长的甘蔗品种(品系),其黑穗病株发病率相对较低;反之,潜伏期较短的甘蔗品种(品系),其黑穗病株发病率相对较高。
2.3甘蔗黑穗病抗性鉴定结果
根据表1甘蔗黑穗病抗性鉴定结果,抗性水平为高抗(HR)的品系有00-319、01-121、00-256、01-125、01-79,占供试品种的14.7%;抗性水平为抗(R)的品种(品系)有01-120、粤糖03-233、CP93-1634,占供试品种的8.8%;抗性水平为中抗(MR)的品种(品系)有粤糖96-86、99-57,占供试品种的5.9%;抗性水平为中感(MS)的品种(品系)有01-246、粤糖95-168、01-160、粤糖91-1102、01-244、粤糖00-318、CP89-2143、CP94-1100,占供试品种的23.5%;抗性水平为感病(S)的品种(品系)有98-73、粤糖99-66、粤糖91-976、ROC22、NCo376、ROC20、粤糖03-393,占供试品种的20.6%;抗性水平为高感(HS)的品种(品系)有ROC10、97-639、粤农83-88、F134、粤糖03-373、粤糖02-205、粤糖02-373、粤糖04-232、NCo310,占供试品种的26.5%。
2.4甘蔗黑穗病田间的自然发病率
由表1可知,在田间黑穗病菌的自然感染条件下,供试甘蔗品种(品系)的黑穗病发生率均较人工接种胁迫下黑穗病发生率明显降低。在田间自然感染条件下,供试品种(品系)的黑穗病株发生率介于0~28%。大部分供试品种(品系)的田间黑穗病自然感染发病率低于10%,甚至不发病。田间自然感染条件下黑穗病发生率较高的品种有ROC22、粤糖99-66和粤糖91-976。
3、讨论
本试验中,34个参试品种(品系)对黑穗病抗性达中抗(MR)或以上抗性水平的占29.4%,抗性水平为中感(MS)或以下的占70.6%,反应出参试品种或品系对黑穗病的抗性水平普遍不高。
20世纪80年代后期,中国大陆开展甘蔗抗黑穗病育种,在甘蔗抗黑穗病鉴定技术、抗性评价体系、抗性机制及抗源筛选等方面做了许多研究,取得了一定成效,先后育成了粤糖85-177、粤糖83-271等高抗甘蔗黑穗病品种,以及引进了高抗黑穗病品种ROC10,并进行了推广应用,对甘蔗黑穗病的发生与流行起到较好的抑制作用。近年来,由于甘蔗黑穗病生理小种的变化,使原有抗病品种抗性丧失,并沦为感病品种,如原高抗黑穗病品种ROC10,在本试验中对黑穗病的抗性为高感。另外,有些感病品种还发展成为绝对主栽培品种,如感病品种ROC22种植面积占总面积的60%以上,导致中国大陆蔗区甘蔗黑穗病发生严重,经济损失重大。因此,加强中国大陆蔗区甘蔗黑穗病菌生理小种鉴定,明确蔗区甘蔗黑穗病菌生理小种类型、优势生理小种及其动态分布,针对优势生理小种进行抗源筛选、杂交组合配制及新抗病品种(品系)选育与推广应用,是扭转当前蔗区甘蔗黑穗病严重发生被动局面的关键措施。
本试验采用人工浸渍接种与田间自然感染相结合的方法,评价供试品种(品系)对甘蔗黑穗病的抗性水平。一些人工接种高感品种(品系),田间自然感染黑穗病发生率并不高,如粤糖03-393、粤糖04-232、粤糖03-337、粤糖02-305等的人工接种鉴定为高感黑穗病,但其田间自然感染黑穗病发生率依次为2%、2%、4%、4%,按照抗性分级标准均为高抗或抗病品种,主要原因是这些品种均为近年新育成品种,其种植造次较少,甘蔗黑穗病菌在种茎中尚未能大量积累;相反人工接种鉴定为感病的品种,如ROC22、粤糖91-976等,其田间自然感染黑穗病发生率相对较高,分别为28%和16%,主要原因是这些品种育成时间较久,种植造次较多,尤其是ROC22连续作为主栽品种种植10多年之久,黑穗病菌在种茎中大量积累,导致其田间自然条件下黑穗病发生率高且危害严重。这与王维赞等的研究结果基本一致。
本试验供试品种NCo310、NCo376、F134是中国台湾地区甘蔗黑粉菌生理小种的鉴别寄主,其中NCo310感小种1、抗小种2,F134感小种2、抗小种1,NCo376对小种1及小种2免疫。中国大陆蔗区由台湾引进甘蔗品种较多且历史较久,从20世纪70至80年代主栽品种F134到目前主栽品种ROC22、ROC16等均为从台湾引进,可以推断中国大陆蔗区甘蔗黑粉菌生理小种应该与中国台湾差不多。本试验中鉴别寄主NCo376(对小种1及小种2免疫)2008年和2012年人工接种黑穗病的发生率分别为50%和43%,说明由于接种源混合冬孢子存在新的生理小种(或致病力变异菌株),导致原免疫品种NCo376变成感病品种。由此可以推断出广东省蔗区已存在新的甘蔗黑穗病菌生理小种。这与沈万宽等和陈健文等的研究结果基本一致。
本试验中,ROC22、ROC20、F134、NCo310及NCo376都参加了2008年和2012年2年的抗性鉴定,虽然同一品种2年的人工接种黑穗病发生率不同,但其抗性鉴定类型一致,反应出传统的甘蔗黑穗病人工浸渍接种鉴定结果具有较好的重演率。这种鉴定方法能够充分保留鉴定品种对黑穗病菌的形态学抗性和生理生化抗性,鉴定结果比较合理、可靠。当然,甘蔗品种对黑穗病的抗性水平是由寄主、病原菌及环境等因素决定的,环境可以影响黑穗病菌的萌芽、菌丝生长等,并影响黑穗病菌的致病力,从而影响甘蔗品种对黑穗病的抗性水平。为了克服不同接种年份、不同接种地点等环境因素对甘蔗品种抗性水平的影响,建议在供试品种中加入一套已知抗性的不同抗性水平的标准品种作为对照。
