在农业生产中由害虫造成的损失占农作物损失总量的１５％以上，因此害虫防治是农业生产中的一项重要任务。昆虫病微生物及其代谢产物已成为生物农药的重要组成部分。苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌ－ｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ）是目前世界上研究最为深入、应用面积最广、且应用最成功的杀虫微生物。自Ｓｃｈｎｅｐｆａｎｄ Ｗｈｉｔｅｌｅｙ分离克隆了第１个Ｂｔ杀虫晶体蛋白基因（ｃｒｙ基因）至今，已经克隆了６２０个ｃｒｙ基 因，ｃｒｙ１类 基 因 数 目 最 多，占２４４种。
ｃｒｙ１Ｉ基因是一类十分特殊的ｃｒｙ１类基因，该类基因编码蛋白只有８１ｋＤ，不同于大多数Ｃｒｙ１蛋白的１３０ｋＤ。已公布的ｃｒｙ１Ｉ类基因主要为ｃｒｙ１Ｉａ、ｃｒｙ１Ｉｂ、ｃｒｙ１Ｉｃ等６类共５０种，其中ｃｒｙ１Ｉｂ类有１１种。Ｔａｉｌｏｒ等从Ｂｔ菌株４８３５中克隆了第１个ｃｒｙ１Ｉ基因ｃｒｙ１Ｉａ１，发现其对鞘翅目的马铃薯甲虫（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）和鳞翅目的欧洲玉米螟（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）具有毒杀活性。后来发现的ｃｒｙ１Ｉａ基因对鞘翅目昆虫均未表现活性。迄今为止，所发现的ｃｒｙ１Ｉ基因所表达的杀虫蛋白主要对鳞翅目夜蛾科 （Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、卷叶蛾科（Ｔｏｒｔｒｉ－ｃｉｄａｅ）、菜蛾科（Ｐｌｕｔｅｌｌｉｄａｅ）和鞘翅目叶甲科（Ｃｈｒｙ－ｓｏｍｅｌｉｄａｅ）的 害 虫 表 现 出 杀 虫 活 性。 另 外，ｃｒｙ１Ｉ类基因在Ｂｔ菌株中多数是沉默的，如ｃｒｙ１Ｉａ１基因在菌株４８３５中就未见表达产物。
ｃｒｙ１Ｉ基因沉默的主要原因可能是，其基因编码区上游与ｃｒｙ１类基因相邻，形成ｃｒｙ１－ｃｒｙ１Ｉ连锁，造成了ｃｒｙ１Ｉ基因自身启动子的缺乏。
近年来的研究发现，ｃｒｙ１Ｉ类基因除了具有较强的杀虫活性和相对较广的杀虫谱，其表达产物与Ｃｒｙ１Ａ类蛋白无交互抗性，这将为解决Ｂｔ毒素杀虫谱较窄、害虫抗药性产生等问题，提供新的备选基因，因此，ｃｒｙ１Ｉ类基因的研究具有重要的理论意义和实用价值。
ＧＳ８是本实验室自行分离的野生菌株，经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ鉴定含有ｃｒｙ１Ｉｂ基因。本研究克隆了该基因，对其进行了序列比对分析，并在大肠杆菌中进行了表达，测定了其基因表达产物对几种主要农业害虫的活性，发现该基因对小菜蛾（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）具有高毒力。
１材料和方法
１．１材料
１．１．１ 菌株与质粒所用菌株和质粒见表1.
１．１．２ 培养基 ＬＢ液体培养基：Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １．０％，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％，ＮａＣｌ １．０％，ｐＨ ７．０。ＬＢ固体培养基：在液体ＬＢ培养基中加入１．２％琼脂粉。
１．１．３酶和生化试剂ＰＣＲ相关试剂购自上海生工。限制 性 内 切 酶、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、ＤＮＡ Ｆｒａｇ－ｍｅｎｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ均购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。
１．１．４供试昆虫甜菜夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、棉 铃 虫 （Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）和 粉 纹 夜 蛾（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）均由河北农业大学昆虫病理与分子生物学实验室提供；小菜蛾（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）由河北省植物保护研究所提供；家蚕（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）品种为菁松×皓月，购于山东广通蚕种集团有限公司。榆兰叶甲（Ｐｙｒｒｈａｌｔａ ａｅｎｅｓｃｅｎｓ）采集于野外。
１．２方法
１．２．１ Ｂｔ质粒的提取采用改进的ＣＴＡＢ方法，参见文献［１５］。ｃｒｙ１Ｉ基因ＰＣＲ－ＲＦＬＰ鉴定、Ｂｔ ｃｒｙ基因和阳性转化子的筛选参考宋福平等方法。
１．２．２ 大肠杆菌分子克隆与检测 Ｅ．ｃｏｌｉ质粒ＤＮＡ提 取、ＤＮＡ酶 切、连 接、转 化、表 达 产 物 和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测参照文献［１５］。
１．２．３ Ｂｔ ＧＳ８菌株中的ｃｒｙ１Ｉｂ基因的ＰＣＲ扩增、克隆和表达参考ＧｅｎＢａｎｋ中公布的ｃｒｙ１Ｉｂ类基因编码区的５＇端和３＇端序列，设计引物：
以ＧＳ８的质粒ＤＮＡ为模板，利用高保真ＤＮＡ聚合酶进行ＰＣＲ扩增。
ＰＣＲ反应条件：９４ ℃预变性４ｍｉｎ；９４ ℃变性１ｍｉｎ；５６．５ ℃退火１ｍｉｎ；７２℃延伸１ｍｉｎ ４０ｓ，３２个循环；最后７２ ℃延伸１０ｍｉｎ。回收ＰＣＲ产物，将目的片段用ＢａｍＨⅠ和ＳａｌⅠ进行双酶切，与以同样酶切处理过的ｐＥＴ２１ｂ进行连接，转化大肠杆菌ＴＧ１，以ＰＣＲ和限制性酶切筛选获得阳性重组克隆。
１．２．４ ｃｒｙ１Ｉｂ基因测序和分析选取阳性重组克隆进行序列测定，ＤＮＡ测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，采用ＤＮＡＭＡＮ、ＤＮＡ－ＳＩＳ等软件和ＥｘＰＡＳｙ数据库分析序列。
１．２．５ ｃｒｙ１Ｉｂ基因在大肠杆菌中表达将含有ｃｒｙ１Ｉｂ全长基因的重组质粒导入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），以ＩＰＴＧ进行诱导，获得ｃｒｙ１Ｉｂ基因的正常表达。诱导条件参见Ｎｏｖａｇｅｎ公司产品说明。
１．２．６ Ｃｒｙ１Ｉｂ蛋白杀虫生物活性测定棉铃虫、粉纹夜蛾和甜菜夜蛾采用饲料表面覆盖法进行生物测定：将饲料平铺于２０ｃｍ２小盒底部，然后将１００μＬ菌液均匀涂布于饲料表面，风干，每盒１０头试虫，重复５次。置于２６．５℃培养箱中，每２４ｈ检查一次活虫数量（以不能顺利进入２龄视为死亡）。家蚕和小菜蛾采用浸液法，将待测菌株按预先设计好的浓度，用无菌水稀释，用清水作为阴性对照。将新鲜叶片清洗，晾干；分别在Ｂｔ菌液中浸润１０ｓ取出，晾干，放入广口瓶中（每片叶柄裹无菌水浸湿的脱脂棉进行叶片保鲜）；每瓶接虫１０头（每个处理１０头虫，５次重复）初孵幼虫。放入２５℃光照培养箱培养，分别于７２ｈ后进行调查。榆兰叶甲参见张杰等方法。测定结果用Ａｂｂｏｔｔ公式计算死亡率。ＬＣ５０和９５％置信应用ＰＯＬＯ软件计算得出。
２结果和分析
２．１全长ｃｒｙ１Ｉｂ基因的扩增及克隆
以ＧＳ８菌株质粒ＤＮＡ为模板，用上述引物进行ＰＣＲ扩增（图１），再经限制性酶切和测序鉴定，证明该菌株含有ｃｒｙ１Ｉｂ的基因。通过ＰＣＲ扩增，从ＧＳ８菌株克隆到全长为２．１６ｋｂ ｃｒｙ１Ｉｂ全长基因，经ＢａｍＨⅠ和ＳａｌⅠ酶切插入表达载体ｐＥＴ－２１ｂ中，获得重组质粒命名为ＴｐＥＴ－１Ｉｂ（图２）。
２．２序列测定及分析
将ＴｐＥＴ－１Ｉｂ进行测序得到ｃｒｙ１Ｉｂ基因的全长 片 段 核 苷 酸 序 列，在ＧｅｎＢａｎｋ登 录 号 为ＥＵ６７７４２２，并由国际Ｂｔ－δ－内毒素基因命名委员会命名为ｃｒｙ１Ｉｂ３。推测了该基因由７１９个氨基酸组成，氨 基 酸 组 成 分 析 表 明 亮 氨 酸 （Ｌｅｕ）、丝 氨 酸（Ｓｅｒ）和苏氨酸（Ｔｈｒ）含量最高，分别为８．９０％，８．６２％，７．９３％；该蛋白预测分子量为８１．３７２ｋＤａ，等电点为ｐＩ ６．２１５，属于弱酸性蛋白。
通过ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ软件分析，结果表明，该蛋白与已公布的６种Ｃｒｙ１Ｉｂ蛋白的氨基酸序列存在差异（表２），是一种新的Ｃｒｙ１Ｉａ蛋白，２００９年国际Ｂｔ杀虫晶体蛋白命名委员会将其命名为Ｃｒｙ１Ｉｂ３。
通过用ＮＣＢＩ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓ分析Ｃｒｙ１Ｉｂ３保守结构域，结果表明，其ＤｏｍａｉｎⅠ是由Ｎ端第６０～２８０位、共２２１个氨基酸残基组成，Ｄｏ－ｍａｉｎⅡ由第２８７～４９７位、共２１１个氨基酸残基组成，ＤｏｍａｉｎⅢ由第５０７～６４４位、共１３８个氨基酸残基组成，因此，Ｃｒｙ１Ｉｂ３蛋白的活性区估计应位于Ｎ端的第６０～６４４个氨基酸残基区域（见图３）。
利用同源建模方法构建了Ｃｒｙ１Ｉｂ３蛋白的三级结构，显示如图５。
２．３ ｃｒｙ１Ｉｂ３基因的表达
将阳性克隆重组质粒ＴｐＥＴ－１Ｉｂ转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经过诱导获得正常表达。对诱导１～２４ｈ的目的蛋白样品进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可见约８１ｋＤ的目的蛋白随诱导时间的延长，蛋白表达量 逐 渐 增 多，到 第６小 时 达 到 最 大，经Ｉｍ－ａｇｅＭａｓｔｅｒ ２ＤＰｌａｔｉｎｕｍ软件分析，约占总蛋白的４５％，同时有６５ｋＤａ的蛋白产生（见图５）。
２．４杀虫生物活性测定
由ｐＥＴ２１ｂ表达的Ｃｒｙ１Ｉｂ３蛋白对小菜蛾有很强的杀虫活性，ＬＣ５０值为０．０７６ ３μｇ／ｍＬ，对其它试虫没有活性（见表３）。
３讨论与结论
本研究利用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ体系，在野生菌株ＧＳ８中鉴定出ｃｒｙ１Ｉｂ基因。在此基础上，从ＧＳ８中克隆了ｃｒｙ１Ｉｂ基因，并在大肠杆菌中成功的表达了８１ｋＤ的重组蛋白。ｃｒｙ１Ｉｂ３基因表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，发现为多条带，产物并不是单一的，分析其编码区序列发现，同一读码框下，不同的起始密码子共用一个终止子，可能是由于在不同起始密码子处翻译所致，也有可能是由于表达蛋白自然降解所致，这有待于进一步研究。而用ｃｒｙ１Ｉｂ３表达产 物 对 供 试 昆 虫 进 行 生 物 活 性 测 定，发 现Ｃｒｙ１Ｉｂ３蛋白对重要的蔬菜害虫小菜蛾显示了高毒力，而对棉铃虫、甜菜夜蛾、粉纹夜蛾、家蚕和榆兰叶甲等未表现出杀虫活性。据报道，由于蛋白自身结构的差异，８１ｋＤ的Ｃｒｙ１Ｉ类与Ｃｒｙ１Ａｂ等１３０ｋＤ的Ｃｒｙ１Ａ类蛋白不存在交互抗性。因此，本研究发现的ｃｒｙ１Ｉｂ３新基因将为我国抗虫转基因作物和工程菌的研制，提供新的基因来源，为筛选、延缓和克服昆虫产生抗性的基因组合提供了重要材料，具有重要的理论和实践意义。
国内外的研究结果证明ｃｒｙ１Ｉ类基因在野生菌株中通常是沉默的，如ｃｒｙ１Ｉａ基因在功株４８３５中就没有表达产物。在ｃｒｙ１Ｉ基因编码区上游一般与ｃｒｙ１类基因相邻，称为ｃｒｙ１－ｃｒｙ１Ｉ连锁，造成了ｃｒｙ１Ｉ基因自身启动子的缺乏，这种现象在Ｂｔ菌株中普遍存在，是ｃｒｙ１Ｉ基因沉默的主要原因。
由此以杀虫活性来筛选菌株的传统方法无法发现该类基因的存在。实际上，ｃｒｙ１Ｉ类基因广泛存在于Ｂｔ菌株中。无论是第１个克隆的对鳞翅目和鞘翅目害虫具有双重活性ｃｒｙ１Ｉａ基因，还是宋福平等克 隆 的ｃｒｙ１Ｉｅ基 因以 及 本 实 验 室 克 隆 的ｃｒｙ１Ｉｂ３基因，该类沉默基因表达产物均对鳞翅目等害虫具有很高的活性，目前，一些ｃｒｙ１Ｉ类基因正应用于抗虫转基因植物的研制。研究结果表明，作为重要杀虫微生物的Ｂｔ菌株而言，其沉默基因资源有着巨大的研究潜力，引起了国内外学者们的关注，有望成为今后Ｂｔ研究新的热点。
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