摘要：【目的】有效利用印楝渣废弃资源研制印楝渣生物药肥，并探讨其对香蕉生长和香蕉枯萎病的影响。【方法】将耐药生防菌（解淀粉芽孢杆菌 HN?11）与印楝渣混合发酵，制备印楝渣生物药肥；通过抑菌和盆栽试验，测定印楝渣生物药肥对香蕉生长的影响以及对香蕉枯萎病的防治效果；采用扫描电镜观察其对病原菌菌丝形态结构的影响。【结果】生防菌解淀粉芽孢杆菌 HN?11对香蕉枯萎病菌 Foc4有明显的抑制作用，抑菌率为 72?1%.生防菌株HN?11与印楝渣具有良好相容性，制备的印楝渣生物药肥施用量为 5%和 10%时，处理组香蕉的长势好于对照，鲜质量、干质量、株高和茎粗均有不同程度的提高，与对照差异显着；施用印楝渣生物药肥组香蕉的病情指数分别为20和 25,对香蕉枯萎病的防病率分别达到72?2%和77?8%;生防菌 HN?11能降低土壤中病原菌 Foc4孢子数，破坏菌丝形态结构。【结论】印楝渣与生防菌 HN?11发酵腐熟施用可避免对香蕉产生药害，制成的印楝渣生物药肥对香蕉的生长具有明显促进作用，能有效控制香蕉枯萎病的发生。
关键词：印楝渣；生物药肥；解淀粉芽孢杆菌；香蕉枯萎病；防治效果。
香蕉枯萎病又称巴拿马病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型 Fusariumoxysporumf.sp.cubense侵染香蕉所引起的毁灭性土传真菌病害，是全球香蕉生产中危害最严重的病害[1?2].目前防治香蕉枯萎病的措施主要有轮作、选育抗病品种、化学防治和生物防治等。但是，香蕉抗病品种育种周期长，短期内难以见效；至今也未研发出特效或高效的化学药剂，常规杀菌剂防治效果不理想，长期使用还将引起农药残留、环境污染、病原菌抗药性等问题[3?4].生物防治作为一种生态安全的防治措施，在香蕉枯萎病防治中越来越受到重视。
施肥防病是最新发展起来的前沿技术，它改变了传统的生物防治方法，为香蕉枯萎病的防治提供了一种新的途径[4?6].生物药肥具有肥料和杀虫或杀菌双重功效，不仅可以有效减轻病虫害、大幅减少化学农药的使用，还能解决一些化学农药难以解决的问题，对有效利用资源、保护生态环境、发展可持续农业具有重要的现实意义。已有报道将生物有机肥与生防菌（如木霉菌、枯草芽胞杆菌、胶质芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌等）混合使用可以有效降低香蕉枯萎病的发病率[4,7?11].但大多数研究只是将腐熟的有机肥和生防菌简单混合使用，鲜见以植物有机物为生防菌培养基质和吸附载体制备生物药肥的报道。
印楝渣是杀虫植物印楝 Azadirachtaindica的种仁提取印楝素后的副产品，因其利用率低而被丢弃但印楝渣仍含有少量具有杀虫、抑菌作用的活性成分，而且还含有大量有机质和微量元素等营养成分以及纤维，可用作生防菌的培养基原料和吸附载体。本研究将耐药生防菌与印楝渣混合发酵，制备印楝渣生物药肥，应用到接种香蕉枯萎病菌的土壤中，探讨其对香蕉生长和香蕉枯萎病防治的影响，旨在为印楝渣资源化利用以及印楝渣生物药肥在香蕉枯萎病生物防治的田间应用提供技术支撑和实践依据。
1 材料与方法
1.1 材料
解淀粉芽孢杆菌 BacillusamyloliquefaciensHN?11从印楝根际土壤中分离并鉴定，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏号CGMCCNO:8421）。香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型 4号生理小种（Fusariumoxysopoyumf.
sp.cubenceRace4,Foc4）由华南农业大学农学院植物病理系姜子德教授提供；携带绿色荧光蛋白 GFP标记的尖孢镰刀菌古巴专化型 4号生理小种（Foc4?GFP）由广东省农业科学院果树研究所李春雨博士提供。印楝渣为印楝种仁提取印楝素后的副产品，颗粒状，粒径为1~2mm.巴西蕉 MusaacuminataAAACavendishcv.Brazil营养杯组培苗由广东省农业科学院果树研究所香蕉组培苗中心提供。供试土壤采自华南农业大学农场，砂壤土，有机质、全氮、全磷、全钾质量分数分别为 20?50、1?12、0?45和 25?4g·kg-1,土壤风干灭菌后备用。
PDA培养基：马铃薯 200?0g,蔗糖 20?0g,琼脂18?0g,蒸馏水 1000mL.NA培养基：蛋白胨 10?0g,牛肉膏 3?0g,氯化钠 5?0g,琼脂 15?0g,蒸馏水1000mL.Landy培养基：葡萄糖 20?0g,L-谷氨酸钠 5?0g,MgSO40?5g,KCl0?5g,KH2PO41?0g,CuSO40?16×10-3g,FeSO40?15×10-3g,MnSO45?0×10-3g,蒸馏水 1000mL.CDM培养基：NaNO33?0g,K2HPO41?0g,MgSO40?5g,KCl0?5g,FeSO40?01g,蔗糖 30?0g,琼脂 15?0g,蒸馏水 1000mL.液体基础培养基：KH2PO41?0g,（NH4）2SO45?0g,NaCl0?1g,MgSO4·7H2O0?5g,CaCl20?1g,酵母膏0?2g,蒸馏水 1000mL,pH7?0.印楝渣固体培养基：印楝渣 95%（w），添加麦麸 5%（w）增加通透性。
1.2 生防菌对香蕉枯萎病菌的抑制作用
1.2.1 平板对峙法
在 PDA培养基平板中心位置一侧 2cm处接种直径为 5mm的香蕉枯萎病菌菌饼，在另一侧对称处接种一环经活化的生防菌HN?11,以不接种生防菌为对照，28℃倒置黑暗培养 5d,观察生防菌 HN?11对病原菌菌丝生长的抑制作用。
1.2.2 抑菌圈法
将生防菌 HN?11在 NA培养基上活化，分别挑取一环接种于含 50mLNA培养基、Landy培养基和 CDM培养基的 250mL三角瓶中，28℃条件下180r·min-1振荡培养2d.培养液离心后经 0?22μm滤膜过滤，得无菌发酵液。将香蕉枯萎病菌 Foc4在 PDA平板上活化，培养 7d后，用无菌水冲洗菌丝制得 Foc4孢子液；吸取 1mL孢子悬浮液（孢子数为 1×107cfu·mL-1），加入到融化并冷却到 45℃左右的 PDA培养基中，混匀，倒平板。待培养基凝固后，将牛津杯依次放置于培养基上，取100μL无菌发酵液加入牛津杯中，以无菌水作空白对照。置于 28℃培养 2d,以抑菌圈大小判断生防菌 HN?11对病原菌 Foc4的抑菌活性。
1.3 生防菌与印楝渣的相容性测定
1.3.1 印楝渣提取液的抑菌作用
取印楝渣 10g,分别加入甲醇、乙酸乙酯和蒸馏水各 10mL,混匀后置于黑暗中浸提 2d,离心取上清液，经 0?22μm无菌过滤器过滤除菌后，根据抑菌圈法测定印楝渣的甲醇、乙酸乙酯和水提取液对解淀粉芽孢杆菌 HN?11生长的影响，以提取溶剂作为对照。以是否产生抑菌圈来判断其对生防菌是否有抑菌活性。
1.3.2 生防菌的生长测定
挑取解淀粉芽孢杆菌HN?11单菌落接种至 NA液体培养基中，以 180r·min-1于 28℃摇瓶中培养 24h,得种子液。将种子液按 2%体积比接入以印楝渣（8?0g）为唯一碳源的液体基础培养基中，对照分别以葡萄糖（8?0g）、可溶性淀粉（8?0g）或玉米粉（8?0g）作为唯一碳源；分别置于摇瓶中，180r·min-1,28℃条件下培养。
48h后分别取1mL发酵菌液，测定各组的 D600nm,判断 HN?11菌株生长能否以印楝渣为唯一碳源。
1.4 抑菌机理
1.4.1 土壤培养法测定抑菌效果
试验设置 3个处理：添加印楝渣（6?0g），接种香蕉枯萎病菌 Foc4?GFP（5mL）；添加生防菌株 HN?11（5mL），接种香蕉枯萎病菌 Foc4?GFP（5mL）；对照只接种香蕉枯萎病菌 Foc4?GFP（5mL），不添加印楝渣和生防菌株HN?11.称取 24?0g灭菌土壤，按照试验处理分别添加印楝渣或生防菌，然后接种 5mL携带绿色荧光蛋白GFP标记的香蕉枯萎病菌 Foc4?GFP（孢子浓度为4×107cfu·mL-1），再加入无菌水 4mL,混匀后置于培养皿中 28℃条件下黑暗培养 2d.每处理分别取1?0g样品，加入 10mL无菌水，摇匀，吸取 10μL上清液滴于载玻片上，荧光显微镜观察病原菌孢子的萌发情况，拍照，并统计相同放大倍数下 3个不同视野中的孢子数。
1.4.2 生防菌对病原菌菌丝形态结构的影响
处理和对照菌丝取自平板对峙法样品，挑取离生防菌最近的病原菌菌丝，分别加入 φ为 3%的戊二醛溶液固定24h,用0?1mol·mL-1磷酸缓冲液（pH7?2）漂洗 3次，用 w为1%的锇酸溶液固定1?5h,磷酸缓冲液再漂洗 3次；用 φ为 30%、50%、75%和 90%的乙醇溶液顺序脱水各 1次，每次 10min;然后以 φ为50%、70%、90%和 100%的乙酸异戊酯溶液分别漂洗 2min.将菌丝置于铜网上干燥，离子溅射喷金后，扫描电镜观察并采集图像。
1.5 印楝渣生物药肥的制备及对香蕉生长和香蕉枯萎病的影响
1.5.1 印楝渣生物药肥的制备
将生防菌 HN?11种子液按体积比 1%接种量，接入含 2L液体 NA培养基的5L三角瓶中，28℃条件下180r·min-1振荡培养 2d.将所得发酵液按 150mL·kg-1的量接种到印楝渣固体培养基中，混匀后培成梯形堆体，置于室温发酵腐熟。发酵过程中，根据需要补充水分，保持湿度 40% ~45%,堆体温度过高时进行翻堆处理。
发酵至堆体不再产热结束，适当喷洒 HN?11发酵液使印楝渣生物药肥中生防菌的含量大于 2×108cfu·g-1.
1.5.2 对香蕉生长的影响 试验设置 3个处理：添加 5%（w）生物药肥；添加 10%（w）印楝渣生物药肥；不添加生物药肥（对照）。每处理按土质量比将生物药肥与风干土（10kg）混匀，装入塑料盆。挑选大小一致香蕉苗（5~6片叶），每盆移栽1株，每5盆1组，每组为 1个重复，共重复 3次。常规浇水管理，60d后调查香蕉苗生长情况，分别测量鲜质量、干质量、株高和茎粗。
1.5.3 对香蕉枯萎病的防治
试验设置 4个处理：添加 5%（w）印楝渣生物药肥，接种 Foc4;添加 10%（w）印楝渣生物药肥，接种 Foc4;不加生物药肥，接种 Foc4（阳性对照）；不加生物药肥，也不接种 Foc4（空白对照）。每处理按土质量比将生物药肥与风干土（10kg）混匀，装入塑料盆。每盆移栽大小一致的香蕉苗（5~6片叶）1株，每 5盆 1组，每组为 1个重复，共重复 3次。待香蕉移栽定植 7d后，除空白对照外，其余处理采用伤根浇入法接种，每盆浇灌 Foc4孢子悬浮液（孢子数为 1×106cfu·mL-1）10mL.常规浇水管理，病原菌接种 30d后调查香蕉苗发病情况，并拍照。
1.6 数据处理试验所得数据经
Excel2007和 SPSS13?0软件进行处理及分析。香蕉枯萎病病情分级标准参照张志红等[8]的方法；病情指数和防病效果的计算参考许志刚[12]的方法：病情指数 =∑（各级发病数 ×该级代表数）/总数 ×最高级代表值 ×100,防病率 =（对照病情指数 -处理病情指数）/对照病情指数 ×100%.
