摘 要： 目的 探讨染色体核型分析与单核苷酸多态性微阵列芯片技术（SingleNucleotidePolymorphismarray,SNP-array）在胎儿单脐动脉的遗传学检查中的应用价值。方法 回顾分析83例妊娠中晚期单脐动脉，行介入性产前诊断羊水或脐带血标本的临床资料，同时行染色体核型分析与染色体微阵列芯片检查。染色体微阵列分析采Illumina Human Cyto SNP12微阵列芯片进行全基因组拷贝数变异（CopyNumberVariations,CNVs）检测，结合查询国际病理性CNVs数据库（ClinGen、ClinVar、DECIPHER、OMIM）、正常人基因组变异数据库（Database of Genomic Variants,DGV）以及PubMed文献数据库等对检出的CNVs的致病性进行分析。结果 83例羊水、脐带血胎儿单脐动脉的胎儿样本中，染色体核型异常检出3例，检出率3.61%(3/83),SNP-array检出9例异常，检出率10.84%(9/83）。染色体异常中，3例羊水染色体核型异常主要为：1例染色体缺失，1例染色体易位，1例染色体嵌合。染色体正常，芯片异常的病例5例为临床意义不明。结论 对超声检出胎儿单脐动脉的胎儿样本，行SNP-array检测有助于发现染色体核型分析无法检出的染色体亚显微结构异常，且SNP-array有利于提高对胎儿单脐动脉的遗传学病因的诊断。
关键词： 单脐动脉; 产前诊断; 单核苷酸多态性微阵列芯片;
Abstract： Objective:To evaluate the application value of chromosome karyotype analysis and single nucleotide polymorphism microarray technology in genetic examination of single umbilical artery fetuses. Method:Retrospective analysis of 83 cases of advanced umbilical artery in the third trimester of pregnancy,the clinical data of interventional prenatal diagnosis of amniotic fluid or cord blood samples,chromosomal karyotype analysis and chromosome microarray chip examination. Chromosomal microarray analysis uses Illumina Human Cyto SNP12 microarray chip for genome-wide copy number variation(CNVs)detection,combined with the query of international pathological CNVs database(ClinGen,ClinVar,DECIPHER,OMIM),normal human genomic variation database(Analysis of the pathogenicity of detected CNVs by Database of Genomic Variants(DGV)and PubMed literature database. Results:In the fetal samples of 83 cases of amniotic fluid and umbilical cord blood,the karyotype was detected in 3 cases,the detection rate was 3.61%(3/83),and the SNP-array detected 9 cases with abnormality,the detection rate was 10.84%(9/83). Among the chromosomal abnormalities,3 cases of amniotic fluid karyotype abnormalities were:1 case of chromosome deletion,1 case of chromosomal translocation,and 1 case of chromosome mosaic. 5 cases with normal chromosomes and abnormalities in the chip are clinically unclear. Conclusions:SNP-array detection of fetal samples of fetal single umbilical arteries can help to detect submicroscopic structural abnormalities that cannot be detected by karyotype analysis,and SNP-array is beneficial for improving the inheritance of fetal single umbilical arteries. Learning the cause of diagnosis.
Keyword： Single umbilical artery; Prenatal diagnosis; Single Nueleotide Polymorphism array;
脐带是连接胎儿与胎盘的条索状组织，正常脐带内有两条脐动脉和一条脐静脉，当脐带内仅有一条脐动脉时，称为单脐动脉（single umbilical artery,SUA),SUA是最常见的脐带畸形，其发生率为0.4%～5.04%[1,2]。是临床上常见的胎儿先天异常情况之一，通常可合并其他结构组织畸形[3]。为探讨妊娠早中晚期胎儿单脐动脉与胎儿染色体异常的关系及其对妊娠结局的影响。本文回顾性分析单纯83例单脐动脉的胎儿产前诊断检测结果，统计染色体核型结果与SNP-array芯片检测结果，以探讨SNP-array芯片技术检测对胎儿单脐动脉胎儿产前诊断中的临床意义，为临床预后评估和遗传咨询提供理论依据。
1、 资料与方法
1.1、 资料来源回顾性分析
2016年1月至2018年10月83例早中晚孕期就诊于广西壮族自治区妇幼保健院，行超声筛查提示胎儿单脐动脉，介入性产前诊断，羊膜腔穿刺或脐带血穿刺取样活检术。同时行染色体核型分析及SNP-array检测，孕妇签署知情同意书后，记录随访妊娠结局。
1.2、 仪器与方法
1.2.1、 试剂：
羊水培养基、秋水仙素、KCl、甲醇、冰乙酸、异丙醇、无水乙醇、胰酶、生理盐水、NaOH、Cyto-12SNP基因芯片等。
1.2.2、 仪器：
应用GE Voluson E6/E10、TOSHIBA APLiO300/400/500,MindrayResona 70B，以及UGEO WS80A,PCR扩增仪（ABI，美国）、iScan(illumina，美国）、高速冷冻离心机（Thermo，美国），Lab-Aid 820核酸提取仪（厦门至善，中国）等。
1.2.3、 超声筛查单脐动脉测量方法：
使用GE Voluson730型彩色多普勒超声仪，经腹扫查，凸阵探头，频率设置为3.5～5.5 MHz。检查方法：所有纳入孕妇均取仰卧位，此后并对胎儿头颅、颜面部位、颈项部、胸腹部内脏器官、四肢、脊柱及胎儿其它附属物等行逐一的超声扫描；同时对胎儿生长参数进行测定，包括双顶径（BPD）、头围（HC）、腹围（AC）及股骨长径（FL），用于分析胎儿是否存在先天异常情况，同时对胎儿数量和形态进行重点检测观察。若经超声检查发生异常表现，可行多切面、多角度的全方位扫查；并对胎儿腹部脐带膀胱入口处进行有效扫查以明确脐动脉缺失侧别情况。
1.2.4、 介入性产前诊断：
筛查过程中发现胎儿单脐动脉，均建议孕妇行介入性产前诊断。妊娠中期（16～22孕周）行羊膜腔穿刺术，妊娠晚期（22孕周后）行脐静脉穿刺术。所有的穿刺样本均分别行染色体核型分析和SNP-array检测技术。
1.2.5、羊水、脐带血DNA提取：
使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德国）试剂盒提取基因组DNA用SNP-array检测；NanoDrop2000(Thermo Fisher scientific INC，美国）测定DNA浓度，保证DNA浓度大于50ng/L,A260/A280在1.8-2.0范围。
1.2.6 、羊水、脐带血染色体核型制备及分析步骤：
将0.1ml20μg/ml的秋水仙素注入培养完成的羊水或脐带血细胞中，作用30min，胰酶消化2.5min，装入15ml离心管内。经1500rpm离心15min，弃去上清液，低渗，预固定、以及3次固定后滴片。80℃烤箱内烘烤6h，采用G显带处理。高倍光学显微镜下观察、分析。显微镜下计数20个核型，分析5个核型，遇到嵌合体加倍计数。
1.2.7、 SNP-array检测：
应用美国Affymetrix Cyto Scan750K芯片平台对样本进行基因组拷贝数变异分析。实验操作严格遵循Affymetrix公司提供的操作流程。采用Affymetrix 7G扫描仪扫描芯片，扫描信号图经Affymetrix的Chas软件分析、计算。
1.2.8、 SNP-array检测的判断和评价：
数据分析参照本实验内部数据库及DGV、DECIPHER、UCSC、OMIM等公共在线数据库。
1.3、 统计学分析：
根据胎儿单脐动脉统计所有入选病例的染色体核型与SNP-array检测结果，随访胎儿异常情况及妊娠结局。
2、 结果
2.1、 染色体核型分析：
83例羊水、脐带血胎儿单脐动脉的胎儿样本中，染色体核型异常检出3例，检出率3.61%(3/83）。染色体异常中，3例羊水染色体核型异常主要为：1例染色体缺失，1例染色体易位，1例染色体嵌合。
表1 SNP-array检出的8例单脐动脉的胎儿中的CNVs结果
2.2、 SNP-array检测结果：
83例羊水、脐带血胎儿单脐动脉的胎儿样本中，SNP-array检出9例异常，检出率10.84%(9/83）。芯片异常主要为2例为致病性变异，6例为临床意义不明拷贝数变异。
2.3、 基因芯片与核型分析对羊水标本检出异常情况见表1。
3、 讨论
单脐动脉是否是产前染色体检查的指征，一直困扰着产科医生，部分学者认为SUA的孕妇无需行胎儿染色体检查，亦有学者认为SUA是染色体异常的高危因素。对于胎儿较珍贵，孕妇丝毫无法承担新生儿异常的患者来说，胎儿染色体检查尤为必要。传统的染色体检查为介入性穿刺，包括羊水穿刺和脐血穿刺。虽然介入性穿刺对于产前诊断来说准确性高，为临床诊断的金标准，但介入性穿刺有造成孕妇出血、流产及伤及胎儿等风险[4]，常给孕妇及家属带来心理和经济上的双重负担，尤其对于一些胎儿较珍贵的孕妇来说尤为如此。因此，如何安全有效并准确的对SUA进行产前筛查是我们需要关注的问题之一。
单核苷酸多态性芯片（SNP-array）技术对非整倍体和不平衡性染色体重排的检出效率和传统核型分析方法相近，并具有更高的分辨率和敏感性，且SNP还能发现额外的，各种临床意义的基因组CNV，尤其是对于产前超声检出发现胎儿结构异常者，SNP是目前有效的遗传学诊断方法[5,6]。由于该基因芯片检测不需要进行细胞培养，因此其适用于细胞培养较难成功的检测样本，或者有明显症状但常规核型分析未检出异常的样本。目前关于染色体微阵列技术在超声异常胎儿中应用的研究越来越多，极大的提高了超声异常胎儿中检测染色体微缺失或微重复综合征的水平[7]。本文研究显示，单纯胎儿单脐动脉行产前诊断技术检查时，染色体核型异常检出率与芯片检测异常检出率上存在较大差异。
83例羊水、脐带血胎儿单脐动脉的胎儿样本中，染色体核型异常检出3例，检出率3.61%(3/83），有研究表明虽然SUA的胎儿合并染色体异常的病例不多，但其存在仍增加了染色体异常的风险[8]。本研究单核苷酸多态性芯片检测技术共计检出2例致病性CNVs病例，以及6例临床意义不明的CNVs病例。本研究中病例1为11号染色体q24.1q25区域，该片段缺失涉及Jacobsen综合征区域，该综合征的临床表现包括发育迟缓、认知损害、智力障碍、学习困难、特殊面容、行为问题等，其中85%的Jacobsen综合征患者为新发缺失，另外15%的患者缺失由于双亲染色体易位导致，该缺失片段目前包含大量已知的OMIM致病基因；同时还存在低比例的X染色体嵌合缺失，嵌合比例约为5-15%，为致病性染色体拷贝数异常。X染色体的缺失可导致特纳综合征。该病因为性染色体X呈单体性所致，发病率约1/2500,99%的病例发生流产。部分出生的特纳综合症患者通常表现为身材矮小和卵巢衰竭，在产前胎儿常表现为头颈部囊性淋巴管瘤、主动脉狭窄和左心发良不全、股骨短、严重的皮下水肿等临床症状。由于羊水标本培养过程易导致染色体丢失，或者制片过程中，异常核型更易漏检出，导致染色体未能检出，尤其是低比例嵌合这种情况。病例2为12号染色体三体嵌合，染色体异常是早期自然流产的最常见病因，尤其是孕周不足6-8w早期流产中，染色体异常发生率可达到50-60%，染色体异常的发生率随母亲年龄增高而增加。12号染色体三体嵌合是较为罕见的致病性染色体拷贝数异常。另外6例检测为临床意义不明，其中病例3涉及7号染色体p21.3p21.2区域存在约3.8M的片段缺失；病例5检测到15号染色体q24.2区域存在约0.4Mb大小的片段缺失，该区域包含1个已知致病的OMIM基因：SIN3A基因可导致Witteveen-Kolk综合征，遗传方式为常染色体显性遗传。该片段缺失在正常人群数据库DGV中有三例报道；病例8为21q21.1q21.2约2.6Mb缺失，病例4检出4号染色体长臂q13.1q13.2区域2.77Mb片段重复，该片段包含一个致病基因GNRHR，该基因与低促性腺激素功能减退症有关，但无文献报道该基因的重复会导致疾病的发生；而病例6为7号染色体p15.3p14.2区域存在约11Mb杂合性缺失区域（AOH），病例7则是12号染色体q21.1q23.1区域约25Mb纯合区域（AOH），对于检出的这两例染色体纯合性区域（AOH），大多数临床意义不明，但需警惕该区域内印记基因、隐性遗传基因的致病风险。当出现与该区域内印记基因、隐性遗传基因的相关的临床表现时，需对相应的基因进一步有针对性的检测。
SNP技术则对致病性CNV检出有明显优势，但仍存不足，在染色体平衡易位、染色体倒位的检测中具有不可替代的作用，以及对大量的微小片段是否致病性的解释所困恼。单脐动脉作为产前检测的重要指征，行常规染色体核型分析并行SNP分析，以获得更多的遗传学信息，为单脐动脉预后评估及遗传咨询指提供更优的临床决策。
参考文献
[1] Malova J,Bohmer D,Luha J,et al. Single umbilical artery and reproduction losses in Slovak population:relation to karyotype and fetal anomalies[J].Bratisl Lek Listy,2018,119(6):330-334.
[2] Khalil MI,Sagr ER,Elrifaei RM,et al. Outcomes of an isolated single umbilical artery in singleton pregnancy:a large study from the Middle East and Gulf region[J].Eur J ObstetGynecol Rep Biology,2013,171(2):277-280.
[3]邓春艳，王晓东，余海燕.胎儿单脐动脉的研究进展[J].中华妇幼临床医学杂志（电子版），2015,11(6):786-788.
[4]高劲松，刘俊涛.介入性产前诊断适应证和禁忌证及应用[J].中国实用妇科与产科杂志，2015,31(9):825-828.
[5] Shaffer LG,Dabell MP,et al. Experience with microarray based comparative genomic hybridization forprental diagnosis in over5000pregnancies[J].Prenat Diagn,2012,32:976-985.
[6] ShafferLG,et al. Detection rates of clinically significant genomic alteration by microarray analysis forspecific anomaliesdetected by ultrasound[J].Prenat Diagn,2012,32:986-995.
[7]李茹，邓琼，廖灿，等.染色体微阵列技术在超声异常胎儿预后评估中的应用[J].实用妇产科杂志，2018,34(11):803-806.
[8]宫润琦，赵颖.胎儿孤立性单脐动脉与染色体异常的关系研究[J].中国实用妇科与产科杂志，2018,34(11):1258-1260.
