丁苯肽预处理对神经细胞体外培养的保护机制

　　丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)是从天然植物芹菜籽中分离提纯并消旋合成的黄色油状液体,具有多靶点抗脑缺血作用[1].动物实验研究表明,丁苯酞可改善微循环,抑制氧自由基和提高抗氧化酶活性,抑制血小板聚集,改善脑灌注,改善线粒体功能;抑制神经细胞凋亡,减小梗死面积. 本文观察丁苯肽预处理对体外培养大鼠皮质神经元,抑制凋亡基因Caspase-3的表达,探讨其神经保护机制.

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1实验动物:健康新生24h内SD大鼠,体质量(7.0±0.5)g,由郑州大学实验动物中心提供.

　　1.1.2试剂及仪器:丁苯酞原液(石药集团恩必普药业有限公司),TUNEL原位凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程公司),兔抗鼠Caspase-3Antibody免疫组化试剂盒(中国医学科学院生物工程研究所),胎牛血清(杭州四季青生物工程公司),DMEM培养液和Neurobasel-Medium细胞饲养液均购自美国Gibco生物工程公司,CO2恒温培养箱(美国Shellab).

　　1.2方法

　　1.2.1细胞标本制作:根据文献[2]方法,进行大鼠皮质神经细胞培养,建立体外缺氧预处理模型.随机取新生24h内SD大鼠,75%酒精消毒后迅速断头取脑,置于冰上盛有D-Hanks液的烧杯中平衡5min,取出脑组织,分离大脑皮质.加入0.125%胰蛋白酶于CO2培养箱(37℃)内消化30min.用口径为0.5mm的火焰刨光的巴斯德吸管反复吹打,200目钢网滤过、离心,收集上层细胞悬液合并于另一试管中.用含有胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液.台盼兰染色,血细胞计数器进行细胞计数,以(1~1.5)×106/mL的密度接种于事先经L-多聚赖氨酸处理的培养皿中,置于CO2培养箱37℃培养.24h后弃去皿内DMEM培养液,全量换入含添加剂B27的Neurobasel-Medium细胞饲养液,以后每3d换液1次.培养第3天用神经元特异性烯醇化酶多克隆抗体标记后,确认皮质神经元.

　　1.2.2预处理方法:细胞培养至10d时,将培养皿随机分为对照组:在正常气体条件下培养24h;丁苯肽预处理组:将培养皿放入缺氧罐内,通入85% N2、10% H2、5% CO2的混合气体20min,夹闭缺氧罐的进出口,放入培养箱内,30min后取出加入丁苯肽原液培养24h;致死性缺氧组:将培养皿放入缺氧罐内培养24h.

　　1.2.3检测方法及结果判定:对3组 培 养 皿 分 别 行Caspase-3免疫组化染色和原位末端标记法(TUNEL)染色.严格按照试剂盒说明书操作.使用DAB显色试剂盒.胞浆或胞核中有棕黄色颗粒者为Caspase-3免疫组化染色阳性细胞.细胞核着紫蓝色为TUNEL染色阳性细胞.

　　1.3统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计学分析.计量资料采用均数±标准差(x珚±s)表示,组间比较用单因素方差分析或t检验,P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1 Caspase-3免疫组化染色.Caspase-3表达的阳性细胞胞浆呈棕黄色,均匀染色.阳性细胞为凋亡细胞,在对照组、致死缺氧组均有表达,无显着性差别 (P>0.05).在丁苯肽预处理组可见表达减少,与其他2组相比有显着性差别(P<0.05).见表1.

　　2.2 TUNEL染色凋亡的神经细胞的胞核着紫蓝色,细胞核形态呈碎片状,不规则,大小不一.TUNEL阳性细胞在对照组和丁苯肽预处理组只有少量表达,而致死缺氧组表达达高峰.见表1.

　　3讨论

　　丁苯酞可作用于急性缺血性卒中的多个环节.丁苯酞是从芹菜籽中提取出的生物活性成分,其作用广泛,可抑制缺血性脑卒中病理生理机制的多个环节,包括改善微循环、抑制兴奋性氨基酸释放,抑制自由基生成,降低细胞内Ca2+超载、提高内皮细胞前列腺素(PGI2)、一氧化氮(NO)表达水平,增强抗氧化酶活性、保护线粒体等.

　　细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主有序的死亡[3].细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,其过程大致可分为以下几个阶段:接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化(Caspase)→进入连续反应过程.

　　Caspase家族是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶超家族.受一定的信号刺激后通过蛋白酶级联反应顺序激活,在细胞凋亡事件中起关键作用.其中Caspase-3为关键的执行分子,在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能.

　　Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存 在 于 胞 浆 中,在 凋 亡 的 早 期 阶 段 被 激 活,活 化 的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡.但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,Caspase-3的活性明显下降.研究[4-5]

　　表明,丁苯肽可以通过保护神经细胞线粒体结构的完整、提高线粒体复合酶Ⅳ的活性、提高线粒体ATP酶的活性和维持线粒体膜的稳定性来维持能量代谢,减少神经细胞的死亡.本文结果显示,丁苯酞预处理组大鼠皮质神经元的存活数量显着大于致死缺氧组,且可抑制凋亡基因Caspase-3的表达,减少神经细胞凋亡,从而最大限度的挽救缺血半暗带.提示丁苯酞可以明显减轻脑缺血性损害,具有脑保护作用.

　　综上所述,本研究通过体外培养大鼠皮质神经元,建立预处理模型,进一步证实丁苯肽可以保护神经细胞,减少其凋亡.如今,对细胞凋亡机制的研究尚处于初期阶段,丁苯肽作为神经保护剂的机制也待于进一步研究,其确切疗效还有待进一步大样本多中心对照研究证实.

　　4参考文献

　　[1] 端木寅,王源,梁爽,等.丁苯酞脑缺血治疗作用的相关药理学研究进展[J].中药药理与临床,2012,28(3):126-130.

　　[2]Choi DW.Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture iscalcium dependent[J].Neurosci Lett,1985,58:293-297.

　　[3]Avramovich-Tirosh Y,Amit T,Bar-Am O,et al.Therapeutictargets and potential of the novel brain-permeable multifunc-tional iron chelator-monoamine oxidase inhbitor drug,M-30,for the treatment of Alzheimer's disease[J].Neurochem,2006,4(19):32-33.

　　[4]Wang Wei,Kong Wei,Chen Meng,et al.Effects of 3-n-bu-tylphthalide pretreatment on endoplasmic reticulum stress inrats with cerebral ischemia reperfusion[J].J Clin Neurol,2013,26(2):122-124.

　　[5] 张学红.丁苯酞软胶囊联合多奈哌齐治疗血管性痴呆疗效观察[J].中国实用神经病学杂志,2013,16(3):70-71.