血清多肽组的基本特征和个体差异探究(2)
时间：2017-06-20 来源：分析化学 作者：孔祥怡,石锴,丛乐乐, 本文字数：5452字 3. 2 血清多肽组的个体差异。
多肽组中发现生物标志物的常用方法是分别分析疾病组和对照组的混合样品，以寻找差异进而进行个体验证，但是，对健康个体样品的分析则较少，本研究以 6 个样本为例探讨血清多肽组的个体差异和共性。首先比较它们的蛋白质数目、肽段数目、信号强度和分子量范围等指标（ 表 2） .结果表明，这些指标在不同样品之间结果差异很大，例如，鉴定的最少和最多的肽段数目分别为 253 和 966 个，而最少和最多的蛋白质数目分别 44 和 104 个。值得注意的是，同一血清样品的肽段数目和蛋白质数目并没有严格的对应关系，例如 253 个肽段对应 56 个蛋白质，而 966 个肽段则归属于 86 个蛋白质。在 6 例个体样本中，肽段数目与蛋白质数目的比值为 4. 5 ~13,这也反映了血清多肽组的个体差异。此外，样品 6的信号强度与样品 3 和 4 相差一个数量级，而该值相差 3 倍以上可认为肽段含量有显着性差别[15],由于样品用量、分离方法和仪器条件均为相同设置，本研究认为这些条件的波动不会对结果造成这么大的影响，而是由于血清样品间的多肽组成差异和浓度不同所导致。
3. 3 血清多肽组的共性。
尽管不同样品血清多肽组的结果存在以上差异，但是，也具有一些共同特点。首先，分子量范围接近。多肽组学的质量范围是一个相对宽泛的概念，Shen 等[16]认为分子量<3 kDa,使用 MALDI-TOF 可很容易将分子量范围拓展至 10 kDa[17],而若将多肽组理解为蛋白质的降解产物，则其分子量可能会更大。但就序列鉴定而言，尽管很早就有报道 Q-TOF 类仪器能鉴定分子量 8. 6 kDa 以上的肽段[18],但是通常液质联用技术鉴定的肽段分子量在 4000 以下[11,12,19],本研究鉴定的所有个体和混合血清样本多肽组的肽段分子量范围都在 800 ~7000 之间。TPDVSSALDKLKEFGNTLEDKARELISRIKQSELSAKMREW-FSETFQKVKEKLKIDS 为最长肽段，归属于载脂蛋白 C-I,质荷比为 1105. 4,带 6 个正电荷，分子量为6632. 5; 进一步分析质谱数据，多肽组中还存在分子量更大的肽段，但因断裂不够而未能鉴定序列。其次，在蛋白质水平上有一些蛋白质出现频率很高，在所有个体样品和混合样品中都可以检测到，例如纤维蛋白原 α 链、胸腺素 β-4、斑联蛋白和血清白蛋白等9 种蛋白质，归属于这些蛋白质的肽段在序列上可能非常相近，例如，只相差一个氨基酸残，提示血清多肽组的序列存在一定变动，此结果说明相比于分子量，序列信息能够更好地反映多肽组结果之间的联系，推测这是当使用不同分子量作为特征值时，各实验室之间的测定结果重现性不佳的原因之一[2].尽管如此，如表3 所示，本研究也发现了一些在所有样品中都存在的共同肽段，除胸腺素 β-4 为阶梯肽段外，其它蛋白质只有 1 条肽段被检测。最后，在所有样品中都发现了一系列分子量十分相近但序列和归属不同的肽段，例如胸腺素 β-4 的 KNPLPSKE-TIEQEKQAGES 与斑联蛋白的 SSPAPAPKFSPVTPKFTPVAS 分子量分别为 2112. 087 和 2112. 129,纤维蛋白原α链的SESGIFTNTKESSSHHPGIAEFPSRG 和 斑 联 蛋 白 的 TQPRGPPASSPAPAPKFSPVTPKFTPV分子量分别为 2758. 309 和 2758. 492,如此相近的质量不能被 MALDI-TOF 分辨，这也说明纳升液相色谱-高分辨串联质谱不仅在肽段的鉴定数目上多于 MALDI-TOF 方法，还可以根据液相色谱保留时间的不同和良好的串联质谱性能而区分分子量相近的肽段。
4 结 论。
本研究基于纳升液相色谱-高分辨串联质谱建立了快速、灵敏和高效的血清多肽组学分析方法，阐明了血清多肽组肽段分布的不均一性和分子量分布范围等多肽组基本特征，发现不同个体样本的血清多肽组即在肽段水平存在共同之处，在蛋白质水平也存在明显差异，提示在利用血清多肽组筛选疾病标志物时需适当考虑个体差异和标志物的稳健性，即肽段序列的差异具有一定偶然性，正常样品的血清多肽组结果同样存在差异，提示并不是所有肽段水平上的差异都与疾病相关。
References:
1 Tinoco A D,Saghatelian A. Biochemistry,2011,50: 7447-7461.
2 Schrader M,Schulz-Knappe P,Fricker L D. Eupa. Open. Proteomcs,2014,3: 171-182.
3 Zapico-Muiz E,Farré-Viladrich A,Rico-Santana N,González-Sastre F,Mora-Brugués J. Pancreas. ,2010 ,39 （ 8 ） :1293-1298.
4 Preianò M,Falcone D,Maggisano G,Montalcini T,Navarra M,Paduano S,Savino R,Terracciano R. Clin. Chim. Acta,2014,437（ 1） : 120-128.
5 Rico Santana N,Zapico Muiz E,Cocho D,Bravo Y,Delgado Mederos R,Martí-Fbregas J. J. Stroke. Cerebrovasc.Dis. ,2014 ,23（ 2） : 235-240.
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8 Nicolardi S,Velstra B,Mertens B J,Bonsing B,Mesker W E. Translational Proteomics,2014,2（ 1） : 39-51.
9 Hayakawa E,Landuyt B,Baggerman G,Cuyvers R,Lavigne R,Luyten W,Schoofs L. Peptides,2013,42: 63-69.
10 WANG Yong,LI Shui-Ming,HE Man-Wen. Chinese J. Anal. Chem. ,2013,41（ 4） : 494-499王 勇，李水明，何曼文。 分析化学，2013,41（ 4） : 494-499.
11 Caseiro A,Ferreira R,Padro A,Quintaneiro C,Pereira A,Marinheiro R,Vitorino R,Amado F. J. Proteome Res. ,2013,12（ 4） : 1700-1709.
12 Paolo N,Fredrik L,Giulia R,Alessandra C,Peter J,Roda A. J. Chromatogr. B,2009,877: 3127-3136.
13 Cheng G,Wang Z G,Liu Y L,Zhang J L,Sun D H,Ni J Z. Chem. Commun. ,2012,48（ 82） : 10240-10242.
14 Zheng X,Baker H,Hancock W S. J. Chromatogr. A,2006,1120 （ 1-2） : 173-184.
15 HONG Xiao-Yu,WANG Hao,XU Jin-Ling,LI Shui-Ming,WANG Yong. Chinese. J. Anal. Chem. ,2016,44 （ 3 ） :403-408.
洪晓愉，王 浩，徐金玲，李水明，王 勇。 分析化学，2016,44（ 3） : 403-408.
16 Shen Y F,Liu T,Tolic' N,Petritis B O,Zhao R,Moore R J,Purvine S O,Camp D G,Smith R D. J. Proteome Res. ,2010,9（ 5） : 2339-2346
17 Liu Y,Wei F,Wang F,Li C,Meng G,Duan H,Ma Q,Zhang W. Biochem. Biophys. Res. Commun,2015,465（ 3） :476-480.
18 Mhring T,Kellmann M,Jürgens M,Schrader M. J. Mass Spectro. ,2005,40（ 2） : 214-226.
19 ZHU Jun,WANG Fang-Jun,DONG Xiao-Li,YE Ming-Liang,ZOU Han-Fa. Scientia Sinica Chimica,2010,40 （ 5 ） :546-555朱 俊，王方军，董小莉，叶明亮，邹汉法。 中国科学： 化学，2010,40（ 5） : 546-555
多肽组中发现生物标志物的常用方法是分别分析疾病组和对照组的混合样品，以寻找差异进而进行个体验证，但是，对健康个体样品的分析则较少，本研究以 6 个样本为例探讨血清多肽组的个体差异和共性。首先比较它们的蛋白质数目、肽段数目、信号强度和分子量范围等指标（ 表 2） .结果表明，这些指标在不同样品之间结果差异很大，例如，鉴定的最少和最多的肽段数目分别为 253 和 966 个，而最少和最多的蛋白质数目分别 44 和 104 个。值得注意的是，同一血清样品的肽段数目和蛋白质数目并没有严格的对应关系，例如 253 个肽段对应 56 个蛋白质，而 966 个肽段则归属于 86 个蛋白质。在 6 例个体样本中，肽段数目与蛋白质数目的比值为 4. 5 ~13,这也反映了血清多肽组的个体差异。此外，样品 6的信号强度与样品 3 和 4 相差一个数量级，而该值相差 3 倍以上可认为肽段含量有显着性差别[15],由于样品用量、分离方法和仪器条件均为相同设置，本研究认为这些条件的波动不会对结果造成这么大的影响，而是由于血清样品间的多肽组成差异和浓度不同所导致。
3. 3 血清多肽组的共性。
尽管不同样品血清多肽组的结果存在以上差异，但是，也具有一些共同特点。首先，分子量范围接近。多肽组学的质量范围是一个相对宽泛的概念，Shen 等[16]认为分子量<3 kDa,使用 MALDI-TOF 可很容易将分子量范围拓展至 10 kDa[17],而若将多肽组理解为蛋白质的降解产物，则其分子量可能会更大。但就序列鉴定而言，尽管很早就有报道 Q-TOF 类仪器能鉴定分子量 8. 6 kDa 以上的肽段[18],但是通常液质联用技术鉴定的肽段分子量在 4000 以下[11,12,19],本研究鉴定的所有个体和混合血清样本多肽组的肽段分子量范围都在 800 ~7000 之间。TPDVSSALDKLKEFGNTLEDKARELISRIKQSELSAKMREW-FSETFQKVKEKLKIDS 为最长肽段，归属于载脂蛋白 C-I,质荷比为 1105. 4,带 6 个正电荷，分子量为6632. 5; 进一步分析质谱数据，多肽组中还存在分子量更大的肽段，但因断裂不够而未能鉴定序列。其次，在蛋白质水平上有一些蛋白质出现频率很高，在所有个体样品和混合样品中都可以检测到，例如纤维蛋白原 α 链、胸腺素 β-4、斑联蛋白和血清白蛋白等9 种蛋白质，归属于这些蛋白质的肽段在序列上可能非常相近，例如，只相差一个氨基酸残，提示血清多肽组的序列存在一定变动，此结果说明相比于分子量，序列信息能够更好地反映多肽组结果之间的联系，推测这是当使用不同分子量作为特征值时，各实验室之间的测定结果重现性不佳的原因之一[2].尽管如此，如表3 所示，本研究也发现了一些在所有样品中都存在的共同肽段，除胸腺素 β-4 为阶梯肽段外，其它蛋白质只有 1 条肽段被检测。最后，在所有样品中都发现了一系列分子量十分相近但序列和归属不同的肽段，例如胸腺素 β-4 的 KNPLPSKE-TIEQEKQAGES 与斑联蛋白的 SSPAPAPKFSPVTPKFTPVAS 分子量分别为 2112. 087 和 2112. 129,纤维蛋白原α链的SESGIFTNTKESSSHHPGIAEFPSRG 和 斑 联 蛋 白 的 TQPRGPPASSPAPAPKFSPVTPKFTPV分子量分别为 2758. 309 和 2758. 492,如此相近的质量不能被 MALDI-TOF 分辨，这也说明纳升液相色谱-高分辨串联质谱不仅在肽段的鉴定数目上多于 MALDI-TOF 方法，还可以根据液相色谱保留时间的不同和良好的串联质谱性能而区分分子量相近的肽段。
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本研究基于纳升液相色谱-高分辨串联质谱建立了快速、灵敏和高效的血清多肽组学分析方法，阐明了血清多肽组肽段分布的不均一性和分子量分布范围等多肽组基本特征，发现不同个体样本的血清多肽组即在肽段水平存在共同之处，在蛋白质水平也存在明显差异，提示在利用血清多肽组筛选疾病标志物时需适当考虑个体差异和标志物的稳健性，即肽段序列的差异具有一定偶然性，正常样品的血清多肽组结果同样存在差异，提示并不是所有肽段水平上的差异都与疾病相关。
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12 Paolo N,Fredrik L,Giulia R,Alessandra C,Peter J,Roda A. J. Chromatogr. B,2009,877: 3127-3136.
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