摘 要： 血管生成是组织修复的必要前提，这是一个复杂的生理过程。近年来，炎症在血管生成和组织再生中的重要作用逐渐受到重视。而巨噬细胞是炎症过程中主要的效应细胞。本文综述了巨噬细胞的不同表型在血管生成中的作用和巨噬细胞与其他细胞的相互作用对血管生长的影响，初步探讨该领域存在的问题和展望。
关键词 : 炎症;巨噬细胞;血管生成;组织再生;生物材料;
Abstract： Angiogenesis is a necessary prerequisite for tissue repair, which is a complex physiological process. Recently, the important role of inflammation in angiogenesis and tissue regeneration has gradually attracted attention. Macrophages are the main effector cells in the inflammation process. This paper reviews the role of macrophages with different phenotypes in angiogenesis, the effect of interactions between macrophages and other cells on angiogenesis, and also point out some problems and prospects in this field.
Keyword： Inflammation; Macrophages; Angiogenesis; Tissue regeneration; biomaterials;
1 、引言
血管生成是组织修复的必要条件，其核心在于炎症反应。理想的组织修复过程是炎症初期破坏病原体，促使血管萌芽；随后组织再生；炎症消退；最后恢复正常组织结构。但是在实际情况中，急性炎症会在破坏有害物质的同时也可能破坏正常细胞，导致组织或器官损伤；而慢性炎症会引起组织破坏和纤维化。巨噬细胞是炎症过程中极其重要的参与者。除了对机体免疫外，巨噬细胞在人体发育、动态平衡、血管生成、组织再生和植入体整合等方面也有举足轻重的地位[1,2]。所以基于巨噬细胞的组织修复治疗策略逐渐受到重视。
未受到极化刺激的巨噬细胞常被称为M0，而受到极化刺激的巨噬细胞通常被分为两种表型：巨噬细胞受脂多糖（LPS）、干扰素-γ（IFN-γ）等炎性介质激活时，表现为M1型，又称经典活化型（classically activated macrophages），在炎症反应中清除侵入性病原体和异物，促进炎症；而巨噬细胞受到白介素-4（IL-4）、IL-10等因子刺激时，表现为M2，又称交替活化型（alternately activated macrophages），在机体中起到抑制炎症、稳定血管生成和组织修复的作用。
2、 M0型巨噬细胞在血管生成中的作用
组织内常驻的巨噬细胞大多为未极化的M0巨噬细胞，是组织发育的关键参与者，对病原体的免疫反应，监测组织变化，尤其是维持组织稳态都具有重要的作用[3]。
Olkowski等[4]使用3D纳米纤维聚苯乙烯支架（NPSs）与M0巨噬细胞共培养，结果显示巨噬细胞分泌的血管内皮生长因子（VEGF）水平上调，它可以通过募集内皮细胞来达到促血管化的目的[5]。Moore等[6]将不同表型的巨噬细胞与主动脉内皮细胞（AECs）包被在具有生物活性的聚乙二醇的水凝胶内，与单独的AECs相比，用M0巨噬细胞与AECs共同包被组的小管体积增加了两倍。可能是因为在水凝胶中AECs与M0巨噬细胞有直接接触的作用。更有研究证明[7]巨噬细胞具有在体内和体外转分化为内皮细胞，内皮祖细胞或内皮样细胞的能力。
总之，M0巨噬细胞有助于血管生成和组织再生，但是巨噬细胞的促血管生成能力大多还是由极化后的表型体现。
3、 M1型巨噬细胞在血管生成中的作用
对于M1巨噬细胞在血管生成中的作用具有一定的争议性。部分研究者认为M1巨噬细胞在血管生成中具有不可或缺的作用。
Gurevich等[8]将原代人M1或M2a巨噬细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养在一层成纤维细胞上。与其它组别相比，M1巨噬细胞诱导了最长的总血管长度，这是因为M1分泌的VEGF水平显着上调。Hsieh等[9]使用外源注入M1巨噬细胞的方法治疗小鼠缺血性肌肉损伤，结果发现损伤早期（1-3天）进行M1治疗改善了血管生成，促进了骨骼肌再生。
Sebastian等[10]设计了一种体外模型，将内皮细胞和周细胞以15:1的比例掺入胶原蛋白I凝胶球中并诱导发芽，然后将上述凝胶球暴露于不同表型巨噬细胞的培养基。结果表明M1巨噬细胞诱导内皮细胞和周细胞的迁移。结合相关研究[5,11]，这可能与VEGF和IL-1b的共同作用有关。Kang等[12]研究表明M1分泌的肿瘤坏死因子（TNF-α）既具有促血管生成又有抗血管生成作用，取决于使用剂量和是否存在周细胞。在无周细胞的存在时，TNF-α的浓度越高，抗血管生成的作用越强；当有周细胞存在时，可以改善高浓度TNF-α引起的抗血管生成的作用。
相反，也有研究认为M1巨噬细胞不会促进血管生成，甚至还会抑制血管的生成。Liu等[13]研究发现，心肌梗死后，M1巨噬细胞释放出大量促炎性外泌体（M1-Exos），其抗血管生成并加速心肌细胞损伤。M1巨噬细胞还表达高水平的促炎性miRNA，例如miR-155。miR-155通过抑制内皮细胞的迁移和增殖来抑制血管形成。而且，Xu等[14]使用褪黑激素将激光诱导的小鼠脉络膜新生血管（CNV）中的巨噬细胞从M2型极化为M1型，这种表型的转变显着降低了CNV病变的体积和血管增殖能力。
由此可见，M1巨噬细胞在血管生成中的作用存在争议，可能是由于以下原因引起的。1）研究者选择了不同种属的细胞作为研究对象。已有研究表明不同来源的巨噬细胞之间有显着性差异[15]。2）不同损伤部位的炎症环境存在差异。比如：糖尿病大鼠的伤口溃疡往往较严重，促炎型M1阶段持续时间过长，对血管生成产生了抑制作用。所以需要尽快将炎症环境转为M2阶段，促进血管生成和组织再生[16]，相反，在小鼠缺血性肌肉损伤的修复中需要丰富的血管新生，也就需要M1型巨噬细胞激发血管萌芽[9]。3）促炎因子的存在时间，例如：Sainson等[17]使用含TNF-α（10 ng/ml）的培养基预处理包被有内皮细胞的纤维蛋白凝胶微球，两天后将含TNF-α的培养基更换为基础培养基，结果显示经TNF-α预处理组萌发的芽数显着多于只使用基础培养基的对照组。但是，如先使用基础培养基处理样品两天，随后再换成含TNF-α的培养基时，该组萌发的芽数反而明显地少于对照组。4）M1巨噬细胞与内皮细胞的接触方式。
4、 M2型巨噬细胞在血管生成中的作用
M2巨噬细胞可稳定血管生成，促进成纤维细胞增殖和细胞外基质（ECM）沉积[18,19]。M2巨噬细胞因不同的刺激物还可以分为以下几种亚型：由IL-4或IL-13诱导的M2a；由免疫复合物（IC）和Toll样受体（TLR）或IL-1R激动剂诱导产生的M2b；由IL-10和糖皮质激素诱导的M2c[20]。三种亚型在血管生成过程中起到不同的作用。
Spiller等[21]研究结果显示M2a巨噬细胞表达高水平的基质金属蛋白酶-3组织抑制剂（TIMP-3），它可以阻断VEGF信号传导和TNF-α的释放。因此，M2a巨噬细胞可通过募集周细胞和调节M1巨噬细胞的信号传导来支持血管生成。另外，M2a巨噬细胞表达并分泌高水平的血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）和碱性成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）[22]，PDGF-BB具有募集周细胞和间充质干细胞，稳定新生血管的作用。如果没有PDGF-BB，仅在VEGF刺激下形成的血管是渗漏的，不成熟易于降解；而FGF-2是一种非常有效的促血管生成有丝分裂原和生长因子。M2c巨噬细胞表达高水平的基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和胎盘长因子（PGF），MMP-9具有刺激血管生成、重塑细胞外基质和趋化内皮细胞的作用；PGF则在M2c诱导的血管生成中起驱动作用[21,22]。
Yue等[23]将心脏成纤维细胞（CF）与不同亚型的巨噬细胞共培养或者与其条件培养基共培养。结果显示，M2b巨噬细胞显着抑制CF的增殖和迁移，纤维化相关蛋白的表达。而M2a的作用与之相反。随后的体内实验中M2b也显示出了抗纤维化的作用。其他的研究[24]中显示M2b与M2a和M2c的区别还在于其保留了高水平的炎性细胞因子表达，并伴有高水平IL-10和低水平IL-12的表达。尽管M2b细胞产生大量炎性细胞因子和有毒分子，但它们可减少脊髓损伤和心肌缺血/再灌注损伤，并有助于这些损伤部位的组织修复[25]。此外，它们促进Th2分化和体液抗体的产生。
M2的不同亚型之间作用机制不尽相同，还需要在以后的研究中更加细化M2亚型的分类及其功能。另外，M2的促血管生成能力并不适用于所有情况，已有研究[26]发现，将M2巨噬细胞注射到糖尿病db / db小鼠的全层切除皮肤伤口中，与空白对照组（注射生理盐水）相比，M2巨噬细胞并不能改善小鼠的血管再生和伤口闭合。提示M1巨噬细胞在促血管生长中的重要地位，即新血管生长需要经历炎症初期M1阶段再转变到M2阶段。过长的M2阶段会造成过度纤维化从而损伤机体，在未来的研究中应当关注如何使M2阶段适时的结束。
5、 由M1到M2的顺序激活在血管生成中的必要性
自然发生的炎症过程就是由促炎型M1阶段适时转入愈合型M2阶段，体外的研究也证明了这种顺序激活M1和M2的必要性。
Spiller等[21]使用不同表型巨噬细胞的条件培养基培养HUVEC，由此观察血管化情况。结果表明HUVEC在M1条件培养基中形成松散互连的血管簇，但在由其他表型（M0、M2a或M2c）或所有三种表型组合（M1、M2a和M2c）的条件培养基中并没有这种现象。当条件培养基在24小时从M1转换为M2a时，血管化类似于体内的自然转变，成管行为明显增强。而当条件培养基在24小时由M1转变成M2c或基础培养基时，没有观察到这种现象。因此，仅当初期存在M1细胞及其释放的炎性信号时，M2a巨噬细胞才能分泌一些引起发芽血管融合的信号（如PDGF-BB等），从而增强成管行为。
Chen等[27]对纯钛表面进行纳米化表面改性，得到二氧化钛纳米管（TNTs）阵列，将抑炎因子IL-4吸附到TNTs后，在其上制备京尼平交联的羧甲基壳聚糖凝胶，再加载促炎因子IFN-γ，最后覆盖一层用β-甘油磷酸钠交联的壳聚糖凝胶。这种携载双重炎性因子的材料体系被用于研究材料引发的初期炎性响应和后期调控。结果表明随着凝胶层的降解，首先是IFN-γ明显释放，形成的炎性环境将巨噬细胞极化为M1表型；随后以IL-4释放为主，导致M1巨噬细胞大量极化为M2型，将促炎阶段转变为促愈合阶段。Yin等[28] 在装载IL-4的TNTs上组装海藻酸钠/壳聚糖的聚电解质多层膜（PEM），再结合京尼平/氯化钙交联剂，以调节IL-4释放。该材料体系在仿生条件下前3天缓慢释放少量IL-4，3天后释放量快速增加。当材料与巨噬细胞共培养时，采用促炎因子刺激的巨噬细胞在前3天保持M1型，高表达促血管出芽的TNF-α, IL-1β 和 VEGF；而在7天时已转化为以M2表型为主，并高表达促血管网络化的PDGF-BB。
这些植入材料的设计表明可通过阶段性控释炎性因子，调节巨噬细胞表型由M1到M2的顺序激活，促进新血管生长，进而组织再生。
6 、巨噬细胞与其他细胞的相互作用
血管生成和组织再生是通过巨噬细胞与其他细胞相互作用实现的。内皮细胞是血管生成过程中必需的细胞，因为血管生成是通过内皮细胞迁移、增殖、排列、分支和吻合等行为实现的。巨噬细胞可以通过作用于内皮细胞实现促进血管生成的作用。反之，内皮细胞对巨噬细胞也有所影响。
在He等的研究[29]中，肝窦窦内皮细胞（IMEC）与造血细胞（HCs）的直接共培养可使HCs分化为巨噬细胞并产生集落，在集落外围，巨噬细胞向M2型极化。当两种细胞间接共培养时，集落则消失而且没有极化现象。并且体内实验表明被IMEC极化的巨噬细胞促进了小鼠体内肿瘤的血管生长。相似的，Jetten等的研究[22]中发现，尽管M1巨噬细胞的条件培养基具有血管生成潜力，但当其与内皮细胞直接共培养时，血管形成受到抑制。这表明内皮细胞和这些巨噬细胞的直接接触抑制了血管形成并抑制巨噬细胞产生促血管生成因子。Moore等[30]使用聚乙二醇水凝胶包被内皮细胞和巨噬细胞，发现内皮细胞会改变巨噬细胞的形态。内皮细胞与巨噬细胞有两种直接接触模式，分别为：巨噬细胞与内皮细胞小管的外壁紧密结合；巨噬细胞桥接内皮尖细胞并作为支持细胞。但是有关巨噬细胞与内皮细胞的膜结合因子及其对血管生长的影响机制目前尚不清楚。
在血管生成过程中，巨噬细胞除了和内皮细胞相互作用外，还与间充质干细胞、成纤维细胞等相互作用。Jukka等研究[31]表明间充质干细胞可以募集巨噬细胞，并且使其向M2表型极化；巨噬细胞对间充质干细胞具有募集、增殖和分化的作用。Nguyen和Miklos等研究[19,32]显示，M2巨噬细胞可以促进成纤维细胞的趋化、增殖和分化；反之，成纤维细胞也会募集巨噬细胞。
Li等[11]设计了一种将IFN-γ加载在5％硅酸钙/ β-磷酸三钙（CaSiO3-β-TCP）上的支架。早期释放IFN-γ以刺激巨噬细胞向M1极化，随后释放Si诱导巨噬细胞向M2极化。将原代人骨髓源性单核细胞（hBMMs）与几种支架共培养，包括β-TCP，IFN-γ-β-TCP，CaSiO3-β-TCP或IFN-γ-CaSiO3-β-TCP。分别收集其上清液作为条件培养基培养HUVEC，用作体外血管形成试验。另以CaSiO3-β-TCP的浸提液也用于血管形成实验，以区别硅酸盐对HUVEC的直接作用。结果表明IFN-γ -CaSiO3-β-TCP与hBMMs的条件培养基用于HUVEC培养时，具有最好的血管生成效果。同时仅材料本身的浸提液也促进了HUVEC的血管生成。
Chen等[33]将聚己内酯（PCL）/F-127通过3D打印技术制备成纳米纤维网。该纳米纤维网和骨髓间充质干细胞（BMSCs）组成一种新型支架。载有BMSCs的3D支架能够增强肉芽组织的形成，促进血管生成并促进胶原蛋白的沉积。而且该支架抑制巨噬细胞向M1型极化并促进其向M2型极化。间充质干细胞因其可分化性，也多用于骨修复方面。
血管生成和组织再生过程是一个多细胞参与的复杂生理过程，在进行组织修复时，如果仅仅考虑巨噬细胞或者巨噬细胞对其他细胞的单向作用，可能不易起到良好的治疗效果。有必要综合性地考察此过程中巨噬细胞与其他细胞的相互作用，才有希望更好地解决组织再生与修复中的难题。
7 、结论和展望
综上所述，巨噬细胞无论是以什么表型存在，包括M0、M1和M2，都对血管生成和组织再生起到重要作用。并且三种表型的作用并不是孤立的，而是相互联系的。在组织修复过程中，巨噬细胞是极为重要的角色，但其他细胞，比如：内皮细胞、成纤维细胞和间充质干细胞，也是不可或缺的。它们与巨噬细胞相互作用，共同达到促血管生成，进而促组织再生的目的。虽然目前对巨噬细胞在血管生成中的作用有了一定的认识，但是无论在理论上还是临床应用中均还存在一些亟待解决的问题，比如：炎性微环境的变化与巨噬细胞表型转换之间的联系及其对血管生成的作用，巨噬细胞不同表型的存在时长对血管生成的影响，巨噬细胞与其他细胞相互作用过程的生化反应、信号通路及其传递机制，内源巨噬细胞的募集效率，外源巨噬细胞的递送方式和时间点，生物植入材料的设计方案，老龄患者组织修复中的血管生成，血管生成中的性别差异等等。
巨噬细胞在血管生成中的作用是涉及多细胞、多蛋白、多生物因子及可变生理微环境的多因素协同过程。通过组织学、细胞学和分子生物学等多层面的实验与理论研究，才可能充分认识其作用机制的科学基础，并由此指导临床应用，更好地服务于患者，造福于社会。
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