骨髓间充质干细胞（BMSCs）也被称为间质祖细胞，由于其巨大的增殖和多向分化潜能，被认为是再生医学、基因治疗和细胞治疗的理想种子来源，已被广泛进行研究[1-3].目前，BMSCs在动物实验和临床应用上取得了巨大的成果，在骨、软骨、肌腱、神经胶质修复、心脏疾病、心肌梗塞、肝脏损伤等方面取得了重大突破[4-6],并且可避免胚胎干细胞和异基因干细胞治疗所涉及的伦理道德和免疫排斥问题，有利于细胞移植。但是骨髓中的BMSCs含量极少，约占骨髓全细胞的0.001%~0.010%[7];因此，需要在体外分离纯化、培养扩增来满足临床应用和实验研究。研究表明，不同分离方法和首次换液方式对BMSCs的增殖培养有很大的影响[8].本试验通过观察2种不同分离方法和不同首次换液时间对兔BMSCs生物活性的影响，旨在建立一种有效的分离培养及鉴定BMSCs的方法，以便获得大量、高纯度、高活性、培养周期短的BMSCs,为下一步研究和临床实验提供基础。
1 材料与方法
1.1实验动物1月龄雄性新西兰大耳白兔1只，由河南省实验动物中心提供。
1.2主要试剂和仪器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜尔迪生物公司）；DMSO（Gibco）；红细胞裂解液（北京赛驰生物技术有限公司）；生物素标记山羊抗兔IgG、HRP标记链霉亲和素、DAB显色试剂盒、改良型苏木素（北京华肽先锋）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗体（北京博奥森）；封闭山羊血清（北京博奥森）。
HF151UV型CO2培养箱（Heal Force）；倒置显微镜（Leica）;800型离心机、85-2恒温磁力搅拌器：金坛市大地自动化仪器厂；数码相机：日本佳能IXUS 980IS;电子天平：METTLER TOLEDO AL104;超净工作台：AIR TECH;FX101-2型电热鼓风干燥箱：上海树立仪器仪表有限公司；pH计：上海雷磁仪器厂。
1.3 BMSCs的提取用陆眠宁（846）将1月龄新西兰大耳白兔麻醉，腿部去毛消毒，无菌条件下分离股骨、胫骨，剔除脂肪和肌肉，PBS液反复冲洗，剪断两侧干骺端，尽量多保留干骺端，DMEM-F12培养液反复冲洗骨髓腔于A、B两个10mL的离心管内，直至骨髓腔发白，1 000r/min离心5min,弃上清。
1.4全骨髓贴壁法A管用PBS重悬细胞，1 000r/min离心5min洗涤2次，弃上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12（1∶100双抗）培养液重悬细胞，接种至3个25cm2培养瓶，补足培养液至5mL,轻柔吹打均匀。置于37℃、5%CO2条件下培养。以后每3d换液1次，待细胞生长融合至80%时传 代 培 养。 先 弃 去 旧 培 养 液，PBS液 浸 洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃条件下孵育3min,含血清的DMEM-F12终止消化。以1∶2的比例传代培养，每3d换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞形态。
1.5红细胞裂解法B管加入1mL红细胞裂解液重悬细胞，静置1~3min,待液体由红色变为白色后，加 入5 mL PBS液，1 000r/min离 心2次，5min/次，弃 上 清。 吸 取3 mL含10% FBS的DMEM-F12（1∶100双抗）培养液重悬细胞，接种至3个25cm2培养瓶，补足培养液至5mL,轻柔吹打均匀。置于37℃、5%CO2条件下培养。
2d后首次换液，以后每3d换液1次，待细胞生长融合至80%时传 代 培 养。 先 弃 去 旧 培 养 液，PBS液 浸 洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃条件下孵育3min,含血清的DMEM-F12终止消化。以1∶2的比例传代培养，每3d换液1次。每天倒置显微镜下观察细胞形态。
1.6兔BMSCs细胞活性检测及生长曲线绘制培养48h时，各取一瓶细胞，弃去培养基，用PBS冲洗2遍，倒置显微镜下观察细胞。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后，0.4%台盼蓝染色，血球计数板计数活细胞（未着色）和死细胞（着色细胞）。分别计算出2种不同分离方法的细胞活性。上述试验重复3次。
选取生长良好的P1、P3和P8代细胞，以2.0×104个/孔，接种于24孔培养板中，每孔1mL,每3d换液1次，每隔1d取3孔，消化后计数，取其平均值为当天的细胞数，连测8d,以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
1.7首次换液时间对兔BMSCs的影响将用红细胞裂解法分离得到的兔BMSCs按首次换液时间随机分为4组：12h换液组、24h换液组、48h换液组、72h换液组，以后每3d换液1次，记录传代前各组0~3代各代培养时间，各代细胞均保留3瓶。
