为探究导致金华市淡色库蚊抗性变化的分子机制,利用 PCR 技术对金华市淡色库蚊相关抗性基因进行检测.本研究综合已报道淡色库蚊抗性基因文献和序列等信息,利用生物信息学手段,设计适合抗性基因引物,并利用该引物获得高质量的目的基因片段.共 对 乙 酰 胆 碱 酯 酶 ( ace1 ) ,P450 超 家 族( cyp6f1) ,非特异性酯酶( Est -2) ,钠离子通道( vssc) ,糖原分支酶( NYD - GBE) ,肌球蛋白( NYD - MLC2)等 6 类基因进行了 PCR 扩增.
1 材料与方法
1. 1 供试昆虫 淡色库蚊金华现场品系
1. 2 试剂 Universal Genomic DNA Extraction KitVer. 3. 0 ( 大连 TaKaRa 公司,生产批号: CA1201 ) 、DNA Marker DL 2000( 大连 TaKaRa 公司 ,生产批号:B2701A) 、Ex Taq DNA 聚合酶( 大连 TaKaRa 公司,生产批号: CKA270113) .
1. 3 仪器 梯度 PCR 仪( 美国 Bio - rad 公司,型号PTC - 1148) ,低温高速离心机( 美国 Thermo Micro 公司,型号 17R) ,电泳仪( 美国 Bio - rad 公司,型号PowrPac Basic) 等.
1. 4 引物设计与合成 根据已报道文献以及抗药性相关基因序列[1 - 4],采用 Verctor NTI 进行序列比对,选取保守序列区进行引物设计,扩增片段应基本涵盖已报道的常见基因突变点,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成( 表 1) .
1. 5 方法
1. 5. 1 模板提取 现场品系以及敏感品系第 1 代、第 2 代 4 龄幼虫各取 20 只,分别匀浆混匀,按 Univer-sal Genomic DNA Extraction Kit 方法提取 DNA.总DNA 提取后,进行琼脂糖凝胶电泳做定性鉴定,保存于 -70 ℃冰箱备用.
1. 5. 2 PCR 反应体系 10 × PCR 缓冲液( 含 Mg2 +)2 μl,dNTPs ( 2. 5 mmol / L) 0. 4 μl,Taq DNA 聚合酶( 5 U/μl) 0. 25 μl,引物( 20 μmol/L) 各 1 μl,模板DNA 2 μl,双蒸水补足至 20 μl.
1. 5. 3 反应程序 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 0. 5 min; 50 ℃~ 60 ℃ 0. 5 min ( 不同引物进行相应调整) ,72 ℃1 min,35 个循环; 72 ℃ 5 min.
1. 5. 4 PCR 产物的检测 1% 琼脂糖凝胶电泳,紫外观察扩增结果.
1. 5. 5 测序 PCR 产物序列测定由上海生工、大连宝生物公司完成.测得序列,利用软件 Chromas 对照相应峰图进行校对.校对后新序列上传 Genbank 数据 库,Accession numbers: HQ540599,HQ540604,HQ540609,HQ540622,HQ540627,HQ540632.
2 结 果
2. 1 PCR 扩增 利用本课题设计的引物,经 PCR 扩增条件优化,均扩增到特异目的片段,见图 1.扩增片段丰度高,且无非特异性杂带和拖尾现象,可用于测序分析.
2. 2 抗性相关基因序列分析 金华现场品系与敏感品系抗性相关基因序列利用 Vector 序列分析软件进行比对分析.其中 vssc 基因序列差异较大,序列相似度仅有 84. 1%,但差异序列主要集中在内含子区,外显子序列完全相同; 非特异性酯酶 Est -2 基因现场品系与敏感品系存在 4 个核苷酸的差异; ace1 基因序列现场品系与敏感品系存在2 个核苷酸的差异; P450 超家族 cyp6f1 基因序列现场品系与敏感品系存在 1 个核苷酸的差异; NYD - GBE、NYD - MLC2 基因序列现场品系与敏感品系无差异,相似度为 100%.见图 2.
2. 3 氨基酸序列分析 为了进一步了解抗性相关基因序列点突变对金华淡色库蚊现场品系抗性表型的影响,我们利用软件 Verctor NTI 软件将发生点突变的序列翻译成氨基酸序列,进行比对.结果显示,ace1基因、cyp6f1 基因、Est - 2 基因的点突变均为无意突变,不会导致氨基酸序列变化.
3 讨 论
高质量的基因片段的克隆是获得好的序列分析结果的基础和重要前提.用于序列测定的 PCR 产物一般要求特异度高,不能存在非特异性扩增片段或拖尾现象等.另外,目的片段产量要高,以提高信噪比或提高克隆测序时的转化成功率.国内外关于库蚊抗性基因扩增的文献报道虽然较多,但检测方法较为混乱[5 -8],所以很难直接用于本课题研究.因此本课题在已有文献的基础上,利用生物信息学技术,对相关抗性基因扩增方法进行了改良或新建.本研究在设计过程中首先通过 Genbank 下载相应的抗性基因序列.利用序列分析软件 Vector 对下载的基因序列进行比对.通过比对,发现目的基因片段区的保守序列,并在该保守序列区检索适于作为引物的序列,进行引物设计.引物设计完成后,利用 NCBI 的 BLAST功能在 Genbank 库内对相近进行检索,检查其特异性.如发现设计引物与其他基因片段在 3'段相同碱基 >6 个,即舍弃重新设计.后经试验证明,本研究所用引物均具有较好的特异性.
本次用于抗性基因监测的蚊种群主要来自于主城区.抗性表型测试显示[9],金华市淡色库蚊主城区品系对常见杀虫剂的抗性水平,除了氯菊酯,基本接近敏感品系.该结果与抗性基因测序结果相一致.
本研究中检测的 6 个基因片段中,金华市淡色库蚊现场品系与敏感品系的氨基酸序列完全相同.
金华市淡色库蚊主城区品系氯菊酯抗性水平明显高于敏感品系.在本研究中抗性基因测序结果无法解释其抗性产生原因,可能已检测的基因片段未覆盖突变位点,或存在其他未知抗性机制.金华市淡色库蚊主城区品系氯菊酯抗性产生机制,还有待进一步研究.
参考文献
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