人腮腺黏液表皮样癌中E2F2和Ki67的表达及意义

　　黏液表皮样癌（MEG）是口腔颌面部常见的原发性涎腺肿瘤，约占涎腺恶性肿瘤的35%.其中，高 度恶 性 的MEG预 后 较 差，5年 生 存 率 仅 有30%[1].对于不能完全切除及远处转移的MEG患者，放、化疗是术后辅助治疗方法。

　　E2F2可以影响细胞分裂周期相关基因的转录，进而影响细胞的增殖、侵袭和分化。

　　Ki67位于细胞核内，同样在细胞的增殖中起重要作用。目前涎腺MEG中对E2F2及Ki67的研究甚少，本研究旨在探讨MEG中E2F2和Ki67的表达及意义。

　　材料与方法。

　　1.材料。

　　（1）标本来源：选取2011年12月-2014年12月腮腺MEG手术新鲜标本（A组）20例、正常腮腺组织（B组）20例。标本转至液氮罐，置于-80℃低温冰箱中保存待用，其余标本送病理科石蜡包埋，行常规病理检查，病理诊断均由2名病理医生确诊。两组组织随机一对一配对。

　　（2）主要试剂：兔抗人E2F2一抗购自美国CST公司；兔抗人Ki67一抗购自英国Abcam公司；羊抗人磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体购自中国中杉金桥公司；TRIzol购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；RT-PCR试剂盒购自瑞士Roche公司。

　　2.方法。

　　（1）RT-PCR检测E2F2及Ki67的mRNA表达：

　　TRIzol法提取两组冰冻组织标本中的总RNA,使用逆转录试剂盒逆转录RNA为cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增。采用相对定量法，以β-actin作为内参，相关目的基因及内参基因序列如表1所示。按10μl反应体系，反应条件为：

　　95℃预变性2min,95℃变性15s,60℃退火30s,72℃延伸30s,40个循环。每个样本设3个副孔，每个样本检测重复3次。采用2-ΔΔCt法计算E2F2和Ki67基因的相对表达量。

　　（2）Western blot法检测E2F2和Ki67的蛋白表达：称取两组冰冻的新鲜组织标本，加入适量的裂解液和蛋白酶抑制剂，匀浆器打磨组织至均匀，4℃以14 000r/min离心，加入5×蛋白上样缓冲液沸水煮5min致蛋白变性，放入-20℃冰箱备用。以蛋白总含量30μg加样，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉封闭液封闭2h,4℃孵育一抗过夜。第2天洗涤缓冲液TBST洗膜3次，每次10min,加二抗室温孵育2h,TBST洗膜3次，每次10min,显影曝光。测定各条带吸光度值，以GAPDH作为内参照，分析校正两组各条带。实验重复3次，Image Lab软件分析各条带灰度值。

　　3.统计学处理。

　　采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量数据用均数±标准差（珚x±s）表示，行配对t检验。

　　P<0.05为差异有统计学意义。

　　结果。

　　RT-PCR检测结果显示，A组E2F2和Ki67的mRNA表达均高于B组[（14.16±1.18）×10-2vs.（1.09±0.24）×10-2和 （12.04±0.65）×10-4vs.（0.58±0.29）×10-4]（P<0.05）。

　　Western blot检测结果显示，A组E2F2和Ki67的蛋白表达高于B组（P<0.05）（图1）。

　　讨论。

　　黏液表皮样癌（MEG）是常见的涎腺恶性肿瘤之一，40-60岁为高发年龄，最常见的发病部位是腮腺、下颌下腺及腭腺。中高度分化的MEG若切除不彻底，较易复发，但淋巴及血行转移较少见。低分化的MEG具有较强的侵袭性，常常与周围组织相粘连，活动度差，淋巴及血型转移较常见。

　　E2F2位于1p36,分子量大小为47.5kD[2],是一种调控细胞有丝分裂的核转录因子[3].E2F2蛋白由细胞质进入细胞核内，结合到靶基因启动子上刺激靶基因转录，促进一系列相关蛋白的表达，即可实现从G1期到S期的转换。E2F2作为多聚梳群基因家族的重要成员，也具有表观修饰酶的作用。

　　它通过甲基化核小体H3的赖氨酸，使下游基因表达受到抑制。绝大多数的下游基因具有抑制肿瘤细胞形成的作用，因其翻译及表达受到抑制，最终肿瘤细胞形成。此外，E2F2还参与细胞的衰竭、分化和细胞周期的调控。有研究表明，肝癌细胞中miRNA-218与miRNA-520a负调控E2F2 mRNA和蛋白表达，进而影响肝癌细胞的增殖，但是E2F2在肝癌中的具体作用未作详细阐释[4].张雅旋等[5]通过抑制胶质瘤E2F2的表达发现其下游靶基因细胞周期蛋白E1mRNA及蛋白表达明显降低，E2F2可以作为胶质瘤靶向治疗的位点。本研究发现，A组E2F2的mRNA和蛋白表达均高于B组，提示E2F2可能与MEG的发生和发展相关。

　　Ki67是一种细胞核抗原，仅仅在增殖细胞中表达，其参与RNA的合成，RNA又是聚合酶1合成所必需的。 Ki67在多种恶性肿瘤中表达，如胃癌、肺癌及鼻咽癌等[6].临床工作过程中，亦常常采用免疫组化的方法检测Ki67.许宁等[7]通过免疫组化染色发现，正常涎腺组织中Ki67基本没有表达，而在涎腺腺样囊性癌中有明显的表达，并且Ki67在筛状/管状腺样囊性癌中的表达明显低于实体型组织中的表达，说明Ki67的表达与病理学分型有关。本研究发现，A组Ki67的mRNA和蛋白表达均高于B组，提示Ki67表达可以在一定的程度上反应腮腺MEG增殖的生物学行为。

　　Bondgaard等[8]发现，肺部神经内分泌肿瘤中E2F2与Ki67的表达呈正相关，E2F2具有促进肿瘤细胞增殖的作用。曹相玫等[9]研究表明，Ki67和E2F2在原发性肝癌组织中的表达呈正相关；在低分化的原发性肝癌组织中，Ki67的表达水平明显低于E2F2,提示E2F2比Ki67更能敏感地反映肿瘤细胞增殖的活性。表明E2F2与Ki67在促进腮腺MEG发生、发展的过程中具有协同作用，E2F2能够促进MEG的增殖。

　　参 考 文 献

　　[1]Rathore AS,Ahuja P,Chhina S,et al.Primary intraosseousmucoepidermoid carcinoma of maxilla[J].J Oral MaxillofacPathol,2014,18（3）：428-431.

　　[2]Zhang Y,Han D,Wei W,et al.MiR-218inhibited growth andmetabolism of human glioblastoma cells by directly targetingE2F2[J].Cell Mol Neurobiol,2015,35（8）：1165-1173.

　　[3]Bollig-Fischer A,Marchetti L,Mitrea C,et al.Modelingtime-dependent transcription effects of HER2oncogene anddiscovery of a role for E2F2in breast cancer cell-matrixadhesion[J].Bioinformatics,2014,30（21）：3036-3043.

　　[4]Dong Y,Zou J,Su S,et al.MicroRNA-218and microRNA-520ainhibit cell proliferation by downregulating E2F2inhepatocellular carcinoma[J].Mol Med Rep,2015,12（1）：1016-1022.