应用于口腔再生领域的成体干细胞综述

　　近年来,医学界多学科已经开始探索利用干细胞和组织工程技术来修复和再生受损的人体器官和组织可能性。干细胞是具有无限或很强自我更新能力的细胞,能产生至少一种高度成熟的细胞,是口腔再生的热点研究领域。让再生医学在临床实践中发挥重要作用是充满希望的治疗形式。

　　本文就应用于口腔再生领域的成体干细胞作一综述。

　　1、各类型的成体干细胞在口腔再生领域的研究

　　1.1骨髓基质干细胞(BMSCs)

　　除了造血祖细胞或干细胞,骨髓中还包含BMSCs,在非造血组织再生中起重要作用。BMSCs从骨髓中分离出来后可以进行体外培养及其鉴定。其STRO-1、CD73、CD90、CD105、CD146表达阳性,CD14、CD34、CD45表达阴性。BMSCs可以取自病人自身的骨髓组织,经过分离培养后可以作为干细胞用于病人自身的组织再生,既克服了免疫排异反应,又避免了交叉感染的可能,并且对病人的手术创伤较小。

　　BMSCs是多潜能干细胞,可以多向分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞及神经细胞等。利用BMSCs向骨及软骨组织方向分化的潜能,将BMSCs作为种子细胞应用于骨和软骨组织再生实验研究获得了巨大进展。KARMER等共同培养牙周膜成纤维系细胞(PDLCs)和BMSCs的结果显示,BMSCs中骨钙素和骨桥素表达强阳性,PDLCs可以诱导BMSCs获得PDLCs的某些特性。

　　BMSCs是牙周组织再生中应用最早最广泛的一种干细胞,再加上BMSCs可以取材自病人自身骨髓,无免疫排异性,易于体外扩增,是最有希望应用于临床牙周组织再生的成体干细胞。将BMSCs负载于生物相容性好、理化性能优良的支架材料并局部释放生长因子是比较理想的一种促进口腔组织再生的方案。

　　1.2脂肪干细胞(ADSCs)

　　脂肪组织作为一种可利用的多分化潜能干细胞来源组织,ZUK等在2001年第一次对ADSCs进行培养和描述。

　　ADSCs在体外分离培养后,细胞增殖和多向分化能力很强,STRO-1以及CD166受体等表达阳性。ADSCs既可以向脂肪、软骨和骨等细胞分化,又可以在特定条件下分化为血管内皮细胞、肌细胞、神经细胞等,在结缔组织和神经组织的修复再生中具有较好的应用前景。ADSCs强阳性表达多个重要骨标记蛋白质,包括碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白和骨钙素。TOBITA等研究结果显示,ADSCs加载富含血小板血浆可以增加大鼠牙周缺损处软硬组织的再生。

　　ADSCs可以通过微创的方法,从日益流行的整容抽脂手术获得,与BMSCs相比,给病人带来的痛苦小,多向分化潜能大,这使得ADSCs作为干细胞来源非常有吸引力,相信通过进一步的基础及临床实验研究,ADSCs在今后的临床实际应用中前景广阔。

　　1.3牙髓干细胞(DPSCs)

　　众所周知,在牙髓损伤后,修复性牙本质在髓室内形成一层防护屏障,这种自然再生能力表明牙髓中可能包含干细胞或祖细胞。DPSCs阳性表达STRO-1,具有自我更新能力和多向分化潜能,可分化为成软骨细胞、脂肪细胞、成牙本质细胞、神经元细胞。将DPSCs加载到羟基磷灰石-磷酸三钙(HA/TCP)的支架材料上,移植到免疫缺陷小鼠体内,6周后可见牙髓牙本质复合体样结构及牙本质涎磷蛋白表达。此外,即使经过2年的低温冻存,DPSCs仍能够分化成前成骨细胞和编织骨,同时保留其细胞完整性。进一步研究表明,将源自上颌前磨牙DPSCs植入支架材料可以修复实验性牙周缺损。然而,ZHANG等[16]将DPSCs植入到三维海绵状胶原-纤维状钛网和多孔陶瓷支架材料后再植入裸鼠体内,6或12周没有形成预期牙髓牙本质复合体,仅分化出类似结缔组织,故DPSCs的再生能力仍存在一定的争论。作为具有高度增殖和自我更新能力的干细胞,DPSCs在牙髓修复和牙齿再生及骨组织工程相关研究中为我们提供了新思路,通过进一步研究,以DPSCs作为种子细胞修复牙体组织缺损或者整个牙齿的再生都是有希望的。

　　1.4牙囊干细胞(DFSCs)

　　牙囊来源于外胚间充质,环绕着牙胚,在开齿的发育过程中形成牙周膜、牙骨质和牙槽骨。DFSCs最初是从人类第三磨牙的牙囊中分离出来,并被证明干细胞标记物STRO-1表达阳性。

　　DFSCs具有异构性,它由三个主要的细胞系构成:高度未分化的牙周膜谱系、成牙骨质谱系和成骨细胞谱系。DFSCs功能类似于其他干细胞,除了可以常规分化为脂肪细胞、骨细胞和神经元细胞外,还可以分化为成牙骨质细胞和牙周膜样组织的牙周组织结构。与DPSCs相比,DFSCs增殖速率更快,细胞表面标记物STRO-1表达更多。

　　DFSCs的细胞永生化趋势既是一个优势也有潜在的肿瘤形成风险,仍然需要广泛的研究。牙囊在牙齿的发育过程中形成牙根部的牙骨质、牙槽骨及牙周膜,DFSCs为形成真正意义上的牙周组织再生带来了希望。

　　1.5乳牙牙髓干细胞(SHEDs)

　　SHEDs可以从人类刚拔除的乳牙残留牙髓组织中获得。TANDON等比较来源于5~14岁儿童炎症牙髓和健康牙髓干细胞的特性,结果显示从炎症牙髓获得的干细胞数量更多,而且标志物与骨髓干细胞相似,认为炎症状态的牙髓也可能成为牙髓干细胞的重要来源之一。SHEDs具有多向分化能力,可分化为神经细胞、脂肪细胞、成牙本质细胞等,STRO-1、CD44、CD146等表达阳性。

　　SHEDs具有较高的增殖率,其增殖率明显高于DPSCs,但其增殖的速度较慢,平均倍增时间为41.3h。CORDEIRO等研究显示,将丙交脂支架负载的SHEDs移植到免疫缺陷小鼠皮下组织,它们分化为成牙质细胞样细胞并形成连续的新生血管供应新植入组织。这些研究表明,SHEDs可以从脱落或者即将脱落的乳牙中获得,完全避免了对病人产生的创伤,安全无痛。

　　SHEDs作为一种安全微创的种子细胞,引起了口腔学者的广泛兴趣。

　　1.6牙乳头干细胞(SCAP)

　　SCAP于2008年第一次被分离培养出来,与BMSCs和DPSCs相比,SCAP显示出类似的成骨细胞和成牙本质细胞的能力,但向脂肪方向分化的能力较弱。

　　SCAP较DPSCs具有更高的增殖率和矿化潜力,STRO-1和CD146均表达阳性,CD34和CD45均表达阴性,SCAP还表达多个牙本质来源的标志物,如牙本质涎磷蛋白、骨钙素及转移生长因子-β等。与DPSCs相比,SCAP表达低水平的牙本质涎蛋白和细胞外基质磷酸糖蛋白。牙乳头可以分化形成牙髓及牙本质,在牙齿的形成和发育中起到了重要作用,将SCAP应用于牙髓再生及牙齿再生具有独特的优势。

　　1.7牙周韧带干细胞(PDLSCs)

　　SEO等于2004年首次成功地培养出人PDLSCs,并通过免疫磁珠及克隆筛选方法将PDLSCs从牙周膜细胞中分离、提纯。PDLSCs的克隆和增殖能力较牙周膜细胞显著提高,其STRO-1和CD146表达阳性。PDLSCs还表达成熟的矿化组织标记物如ALP、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、骨桥蛋白、骨钙素、骨涎蛋白。

　　PDLSCs具有成体干细胞的基本特点,拥有分化为脂肪细胞、成牙骨质细胞、成骨细胞、胶原形成细胞的能力。IVANOVSKI等以羟基磷灰石-磷酸三钙作为支架材料,负载PDLSCs后植入裸鼠皮下,发现裸鼠体内可以形成牙骨质、牙周膜样结构,并且形成类似牙周膜样的纤维结缔组织及牙骨质样和骨样硬组织。

　　PDLSCs的多分化潜能,可以使其分化为比较成熟的牙周膜细胞及成牙骨质细胞,比较接近于完全意义上的牙周组织自我更新。PDLSCs为牙周组织再生带来了突破,相信通过进一步的基础和临床研究,PDLSCs以其独特优势必将为牙周组织工程的临床实际应用带来飞跃。

　　1.8牙槽骨干细胞

　　牙槽骨与牙周膜相似,来源于胚胎发育期的牙囊。通过微创手术可从牙槽骨边缘分离获得牙槽骨干细胞。牙槽骨干细胞表现出高度可塑性和克隆形成能力,并表达表面标记物CD73、CD90、STRO-1和CD146,而缺乏造血标记物CD14、CD34、CD45的表达。这些细胞可以分化为成骨细胞、成脂肪细胞、成软骨细胞等,并高表达ALP和Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原。口腔种植及牙周炎的临床治疗中牙槽骨高度不足一直困扰着广大口腔临床医生,而牙槽骨干细胞的出现则提供了一个新的研究方向。

　　1.9牙龈干细胞

　　牙龈作为牙周组织的一部分,其典型特点是惊人的再生和创口愈合能力,可以快速重建组织并不伴有瘢痕形成。牙龈干细胞具有多种功能,在生长因子的作用下具有多样性,在愈合过程中细胞可产生特定的细胞外基质蛋白质,证明牙龈结缔组织含有异质性细胞。牙龈干细胞表达CD73、CD90、CD105,不表达CD14、CD34和CD45。牙龈干细胞可分化为成脂细胞、成软骨细胞和造血细胞。最近的一项研究进一步显示了牙龈干细胞的牙周组织再生潜力,将牙龈干细胞结合胶原和脱矿小牛松质骨可有效地促进牙周组织再生。人类齿龈最易于组织活检,并被认为是一种理想的干细胞来源。牙龈干细胞最大的优点是来源广泛并能够大量获得,而不需要破坏牙髓、牙周膜或牙囊。牙龈干细胞虽然来源于成纤维细胞,但可以向牙周膜及牙槽骨方向分化,可以弥补牙周膜干细胞来源有限、取材困难的缺点,有望更安全高效地应用于临床牙周组织再生。

　　2、小结

　　间充质来源的成体干细胞一般都是通过多向分化潜能(成骨、成软骨、成脂)及STRO-1、CD44、CD146、CD166等表面标记物表达进行鉴定。造血干细胞一般通过CD34、CD133标记物进行鉴定。通过表面标记物鉴定的方法虽然被广泛使用,但到目前为止还不能肯定地说只要相关标记物表达阳性就可以100%确定为干细胞,更不能作为鉴定不同来源干细胞的惟一标准。

　　BMSCs被广泛应用于组织修复再生的研究,但仅停留于实验室及初级临床研究阶段,尚未达到安全、稳定、广泛地临床应用阶段。一项医学新技术必须经过严谨科学的临床实验才可能被大规模推广应用,相信经过广大学者的不断努力,干细胞治疗各种疾病的临床应用时代很快就会到来。

　　组织工程里支架和种子细胞是两个重要因素,当然还有生长环境的刺激,如生长因子的潜在促进作用。生长因子的局部应用对于口腔组织再生也具有非常重要的意义,但目前口腔组织再生的研究以干细胞加支架材料的形式比较多,同时加载生长因子的研究还比较少。如富含血小板血浆,可以由病人自身提取并富含多种生长因子,既避免了交叉感染又可通过多种生长因子的协同作用促进口腔组织再生。釉基质蛋白是从牙胚的成釉器中提取的牙源性蛋白,可以诱导多能干细胞系细胞向成骨细胞转化,并能促进成骨细胞系的增殖和分化,还可以促进牙周缺损部位牙根表面无细胞牙骨质及牙周膜成纤维细胞生成。将干细胞和生长因子联合应用于口腔再生是今后的一个发展方向。

　　上海第九人民医院研究团队将基因转染技术应用于组织工程的研究。CHANG等将血管内皮生长因子-165基因转染入BMSCs,并与游离的脂肪组织混合后注射入大鼠皮下,术后30~90d与对照组相比,血管内皮生长因子-165的转染促进了移植脂肪组织的生存及更多微血管的再生。JIANG等构建骨形成蛋白-4基因质粒并转染兔骨髓基质干细胞,结合组织工程技术修复兔的下颌骨缺损,取得了良好的骨再生效果。

　　成体干细胞作为口腔组织再生的种子细胞已经在众多基础实验及临床应用上进行了初步研究和探讨,但基本上都是单独以一种干细胞作为种子细胞,复合于各种支架材料中促进口腔组织再生,再生的效果仍不理想。将两种或多种干细胞共同培养,再复合适当的支架材料,促进口腔再生可能是今后的一个研究方向。如将DPSCs、SCAP与DFSCs按牙齿的构成顺序进行培养并复合于适当的支架材料上,或许可以取得更好的牙齿再生效果。

　　口腔干细胞的生物学特性和发育潜能仍需要进一步探索,对口腔干细胞更深入的研究和理解将有助于口腔疾病的治疗,给临床工作带来新的思路。

　　参考文献：
　　[1]吴广升,惠光艳,关继东,等.CH-GP凝胶负载富含血小板血浆促进牙周再生效果[J].青岛大学医学院学报,2013,49(1):78-80.
　　[2]刘丽霞,吴广升,关继东,等.壳聚糖温敏凝胶并PRP对骨髓基质细胞增殖分化影响[J].齐鲁医学杂志,2012,27(4):363-365.