摘 要： 研究肉桂精油抑制莲子中黄曲霉毒素作用, 采用熏蒸法和滤纸片法观察黄曲霉菌的抑制效果, 结果表明滤纸片法下肉桂精油浓度为2μL/m L时, 抑制黄曲霉生长, 熏蒸方法下精油浓度为1.5μL/m L时, 黄曲霉毒素被抑制, 肉桂精油对莲子中黄曲霉毒素的污染起到的保护作用。
关键词： 黄曲霉; 莲子; 肉桂精油;
Abstract： The effect of cinnamon oil on the inhibition of aflatoxin in lotus seeds was studied. The inhibitory effect of Aspergillus flavus was observed by fumigation method and filter paper method. The results showed that when the concentration of cinnamon essential oil was 2 μL/m L, the growth of Aspergillus flavus was inhibited and fumigation was inhibited. When the concentration of essential oil was 1. 5 μL/m L, aflatoxin was inhibited and cinnamon essential oil protected the aflatoxin contamination in lotus seeds.
Keyword： Aspergillus flavus; Lotus seeds; Cinnamon essential oil;
肉桂 (Cinnamomum cassia Presl) , 主要产于广东、福建等热带及亚热带地区, 常用于治疗肾阳虚、阳痿等疾病[1,2]。肉桂油具有明显的体外抗菌和抗真菌作用[3,4]。肉桂精油是肉桂的主要成分, 能抑制真菌生长, 对人体相无毒无害、生物降解性良好, 在中药防霉中发挥了不可替代的作用。
1、 材料与方法
1.1、 试验材料
所用实验材料见表1。
1.2、 试验方法
1.2.1、 超声波法提取肉桂精油
肉桂粉碎过30目筛, 加入丙酮, 在超声波密度为12/cm3的条件下提取, 待样品冷却后过滤, 洗涤, 得肉桂精油粗提液, 低温条件下使样品中的丙酮挥发, 得到肉桂精油。
表1 材料名称及厂家Tab.1 Material name and manufacturer
1.2.2、 肉桂精油成分测定
吸收波长的测定:吸0.5 m L提取的肉桂精油, 加乙醇至50 m L, 混匀, 量取1.0 m L, 再用水稀释至50m L, 吸1.5 m L和2.0 m L, 用水稀释至浓度为0.000 6%、0.000 8%进行扫描, 确定其最大接收波长为291 nm。
吸0.1 m L提取的样品肉桂精油, 加乙醇至100m L, 混匀, 取1.0 m L加水至50 m L, 取0、0.5、1.0、1.5和2.0 m L的精油定容至50 m L容量瓶中。使用0.000 2%、0.000 4%、0.000 6%和0.000 8%的浓度建立标准曲线。得:Y=2 117.3x, R2=0.999 7。
精油提取率的计算公式为:
W1:肉桂醛的含量 (g) ;W2:精油提取率;C:体积浓度;N:稀释倍数;ρ1:肉桂醛密度;ρ2:精油密度;M1:精油总质量, M2:肉桂粉质量。
气相色谱串联质谱 (GC-MS) 条件:
DB-17MS石英毛细管柱 (60 mm×0.25 mm×0.25μm) , 用氦气作为载气, 设置分流比为1∶50, 柱流速为1.0 m L/min, 柱温:初始温度40℃, 10 min后以5℃/min保持至180℃10 min, 然后15℃/min至300℃, 入口温度At 250℃, EI源电子能量为70e V, 电子倍增电压为2 328 V, 质谱扫描范围29~350 amu。
1.2.3、 精油抑制作用的研究
黄曲霉菌复苏:首先将菌种冻干粉放置室温, 之后称取0.1 g, 在无菌状态下, 将其溶解在事先灭好菌的50 m L无菌水中, 28℃摇床培养60 min, 吸取100μL样品液接种于察式培养基中, 放入生化培养箱, 28℃±2℃培养7 d。
黄曲霉孢子悬浮液的制备:取一支长有黄曲霉菌的培养基, 无菌条件下加入5 m L 0.1%吐温, 用接种环挑取黄曲霉单菌落, 放入三井瓶中28℃摇床培养24 h, 慢性定性滤纸过滤。将滤液用0.85%生理盐水继续稀释并在光学显微镜下用血细胞计数器计数以将浓度调节至106/m L获得黄曲霉的孢子悬浮液。
滤纸片法研究肉桂精油对黄曲霉菌的抑制作用:将不同体积的肉桂精油, 分别用0.001%吐温-80的无菌水溶解, 控制肉桂精油浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5和2.0μL/m L。然后将灭好菌的无菌0.7 um圆玻璃纤维滤纸片放入这些不同浓度的肉桂精油中浸泡10 min。在超净工作台中, 用移液枪吸取50μL样品液, 接种在培养基上, 在无菌条件下将完全湿润的圆滤纸片沥干贴在培养基中央, 对照组只用吐温的无菌水, 将培养皿倒置放入恒温 (28℃±2℃) 培养箱中培养7 d。隔两天观察测菌落生长的径向直径, 求平均值。每个实验重复3次。计算公式为:
W3:菌丝抑制率, Dt:分别为实验组菌落直径平均值, Dc:对照组的菌落直径的平均值。
熏蒸法评价肉桂精油对黄曲霉菌的抑制作用:量取25 m L培养基, 倒入培养皿中, 静置, 冷却凝固后, 准确吸取100μL样品液, 接种在培养基上;将无菌的滤纸片贴在培养皿的上盖, 分别将0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5和2.0μL/m L浓度的肉桂精油滴入到无菌滤纸上, 待完全吸收, 对照组不添加精油, 将培养皿密封, 倒置放在恒温 (28℃±2℃) 生化培养箱中培养7 d。隔两天测菌落生长的径向直径, 求平均值, 重复3次。
最小抑菌浓度 (MIC) 和最小杀菌浓度 (MFC) 的检测:将配好的黄曲霉菌孢子悬浮液接种到25 m L的培养基内, 用无菌滤纸覆盖培养皿的盖子并将其黏贴, 将不同浓度的肉桂精油缓慢滴加在无菌滤纸上, 等完全吸收后, 盖上培养皿, 密封。观察实验组的培养基中是否出现菌丝体生长, 其中精油浓度最低的可视为最小抑菌浓度 (MIC) 。首先保留上述实验组中所有没有出现过菌丝体生长的培养皿, 再将以前的培养皿上盖用新的无菌培养皿盖替换, 封口膜密封, 在完全相同的条件下培养3 d。观察黄曲霉菌菌丝体的生长状况, 完全抑制黄曲霉菌丝体生长的肉桂精油浓度, 可视为最小杀菌浓度。
2、 结果与分析
在超声波密度为12 W/cm3时提取25 min, 精油提取率为2.94%。根据谱图与仪器文库的数据比较表明, 在34.889 min前后出峰, 峰面积约189 495 087cm2的为肉桂醛, 是肉桂油的主要构成成分, 其次是肉桂醇, 出峰时间在46.609 min左右, 峰面积约为12 650 039 cm2。
图1 肉桂油GC-MS图谱Fig.1 Cinnamon oil GC-MS map
3、 讨论
研究不同浓度下肉桂精油对莲子种子中黄曲霉毒素的抑制作用。肉桂精油抑制黄曲霉的最小MIC, 熏蒸方法下, 当肉桂精油浓度为1.5μL/m L时, 黄曲霉被完全抑制, 而滤纸片法时肉桂精油浓度达到2.0μL/m L, 黄曲霉停止生长。
参考文献：
[1]赵凯, 薛培凤, 屠鹏飞.肉桂的化学成分及其生物活性研究进展[J].内蒙古医科大学学报, 2013, 35 (01) :63-74.
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[3]毕文.肉桂油中抗菌物质的研究进展[J].甘肃科技, 2012, 28 (09) :145-146.
[4]刘笑宇.肉桂精油的抑菌作用、抑菌机理及其在酱牛肉防腐中的应用[D].上海:上海应用技术学院, 2015.
