降解环氧丙烷生产废水的高效菌株的培养

　　0、 前 言

　　环氧丙烷（PO），又名氧化丙烯、甲基环氧乙烷，是非常重要的有机化合物原料，主要用于生产聚醚多元醇、丙二醇和各类非离子表面活性剂等，其中聚醚多元醇是胶粘剂、涂料和弹性体等重要原料之一。随着环保理念的不断提升，人们对胶粘剂、涂料等应用，除了要求其性能优异外，还要求其生产工艺的绿色化，并对其产物的后处理也极其关注。

　　国内70%以上是采用氯醇法制备PO的生产装置，故由此产生的废水属于高含盐有机废水，并且含有难生化降解的有机氯化合物。由于生化法具有绝对的成本优势，故寻找适宜的耐盐菌处理高盐废水是该研究领域的热点之一（如Woolard等将一株从美国大盐湖中分离而得的中度嗜盐菌用于苯酚废水的处理）。针对PO生产废水，研究者主要通过更改工艺流程或增加预处理环节来提高降解效果；然而，由于试验废水大都根据原废水成分配制而得，故废水的处理成本增加、实际操作可靠性降低。

　　本研究从运城盐湖中分离得到耐盐菌，并经过长时间的培养驯化，得到一株能直接在PO生产废水中生长繁殖、降解其CODc（r重铬酸钾法测得的化学需氧量）的耐盐菌YH-2；通过对该菌株的微观形貌分析和强化废水处理的相关试验，为分离耐盐菌应用于PO生产废水的处理提供了有效的理论依据。

　　1、 试验部分

　　1.1 试验原料

　　（1）菌种：采自运城盐湖泥水混合区域。

　　（2）废水来源及水质：来自山东省某 PO 生产厂（其中 CODcr=1.85 g/L、Cl-=26.89 g/L、Ca2+=17.06 g/L和pH=12.4）。

　　（3）培养基：高氏1号培养基作为富集培养基，驯化培养时添加一定浓度的PO生产原废水；牛肉蛋白胨培养基作为固体培养基；无机盐培养基组成为1 g/L KNO3、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L MgSO4、0.01 g/LFeSO4和0.5 L/L废水，pH=7.2~7.4；所用化学试剂均为国产分析纯。

　　1.2 试验仪器

　　SPX-150-D型震荡培养箱、BL-50A型立式压力蒸气灭菌锅，上海博讯公司；721-2000型分光光度计、YP502N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；无菌操作台，苏净集团安泰公司；XSZ-HS7型三目生物显微镜，重庆光电仪器有限公司；PHB-5型精密pH计，上海伟业仪器厂。

　　1.3 试验制备

　　1.3.1 微生物的驯化筛选

　　将盐湖泥水制成的菌悬液接种至富集培养基中，30 ℃、120 r/min时连续震荡培养24 h；然后从中取2 mL培养液接种至驯化培养基中（废水浓度以5%的梯度增加），在相同的温度和转速条件下连续震荡培养若干时间；待废水浓度增至30%时，适当延长培养时间。驯化过程中使用涂布法在固体培养基上观察菌落的变化情况。

　　1.3.2 菌种的分离纯化及高效菌的筛选

　　在固体培养基平板上反复划线分离得到纯种菌，将纯种菌落接种至无机盐培养基中；相同条件下连续震荡培养若干时间，目的是筛选驯化出以废水中有机物为唯一碳源的菌种，并通过测定无机盐培养基的CODcr值，进一步筛选出对废水降解效果较好的菌种。

　　1.3.3 微生物在废水中的生长繁殖

　　将YH-2接种至未添加任何无机盐的PO生产废水（pH=8~10）中，通过测定其OD（光密度）来判断其是否能存活甚至生长繁殖，同时绘制其在废水中的生长曲线。

　　1.4 测试或表征

　　（1）pH：采用精密pH计进行测定。

　　（2）化学需氧量（CODcr）：按照 GB/T 11914—1989标准，采用重铬酸钾法进行测定。

　　（3）光密度（OD600）：采用分光光度计在600 nm处进行测定（每间隔8 h测定1次）。

　　（4）微观形貌：采用三目生物显微镜进行观测。

　　2、 结果与讨论

　　2.1 菌种的分离

　　经过长时间驯化筛选、多次划线分离，从盐湖中得到的YH-2为革兰氏阳性菌，接触酶阳性；幼年菌落为乳白色，圆形扁平状，表面呈卷曲状，菌落表面干燥，不易挑取；随培养时间增长，出现半透明淡黄色无规则的黏液层，表面变得湿润，显微镜观察得其外观呈短杆状，尺寸为（0.4~0.7）μm×（1.4~2.5）μm，无鞭毛（见图1）。

　　2.2 YH-2在废水中的生长曲线和废水的pH变化

　　图2为YH-2在废水中的生长曲线（即OD600-时间曲线）及废水pH-时间曲线。

　　由图 2 可知：在未添加任何营养物质的废水中，YH-2经过16 h的适应后分泌出可断裂有机物键链的酶（该酶可分解废水中的有机物质，并被微生物有效利用，为微生物繁殖合成新的细胞结构提供必要的碳源、氮源），OD600值持续增长136 h之后稍有下降。48 h内废水的pH由初始10降至6.5以下，之后一直保持在6.3~6.5之间。这是由于微生物在裂解大分子有机物的同时会改变废水的pH；同时微生物分泌物也属于弱酸性物质，致使废水的pH快速下降，最后呈弱酸性；而微生物分泌的裂解性酶在弱酸性条件下活性更好，更有利于其对废水的降解。随着微生物的不断生长，废水的pH变化更有利于微生物对废水的进一步降解。

　　2.3 YH-2降解PO生产废水的影响因素

　　2.3.1 菌种培养时间对降解效果的影响

　　将不同培养时间的YH-2接种至30 mL的PO生产废水中，在 30 ℃、120 r/min 的条件下连续震荡3 d，则YH-2的培养时间对废水CODcr降解率的影响如图3所示。

　　由图3可知：菌种的培养时间对废水CODcr的降解效果影响较大，培养3 d的微生物对废水降解效果相对最好，其CODcr降解率达41.3%。结合图2中的生长曲线可以看出，YH-2在3 d时达到稳定期，而稳定期的菌种能更好适应新的环境，对PO生产废水有更好的降解效果。因此，本研究选择培养3 d的菌液进行后续研究。

　　2.3.2 初始废水pH对降解效果的影响

　　接种等量（培养3 d）的微生物至不同初始pH的废水中，在30 ℃、120 r/min的条件下连续震荡3 d，则初始废水pH对废水CODcr降解率的影响如图4所示。

　　由图4可知：废水初始pH为10时，微生物的降解效果相对最好，其CODcr降解率达到59.9%。偏碱性的初始环境能降低废水对微生物的毒性，保护微生物逐渐适应废水环境。结合图2中废水的pH-时间曲线可以看出，微生物通过分泌物不断调节废水的pH，直至废水呈弱酸性。综上所述，初始pH条件的保护作用与微生物的自身调节相结合，能使微生物的降解效果达到最佳。

　　2.3.3 降解时间对降解效果的影响

　　废水的初始pH调至10，将培养3 d的菌液接种至30 mL的废水中，在30 ℃、120 r/min的条件下连续震荡若干时间。则 YH-2 的降解时间对废水CODcr降解率的影响如图5所示。

　　由图5可知：CODcr降解率随降解时间延长呈先升后降态势，并且在降解时间为 5 d 时相对最大（68.4%）。这是由于降解时间过长时，废水中的成分越来越难以生物降解，必要营养物质的极度缺乏抑制了微生物的生长繁殖；此时微生物出现衰亡（造成CODcr降解率下降），不再适合对废水的继续降解。

　　2.3.4 温度对降解效果的影响

　　废水的初始pH调至10，将培养3 d的菌液接种至30 mL的废水中，分别在不同温度、120 r/min的条件下连续震荡5 d，则不同温度对废水CODcr降解率的影响如图6所示。

　　由图6可知：随着温度的上升，CODcr的降解率呈先升后降态势，并且在温度为 32 ℃时相对最大（70.9%）。这是由于温度是影响酶活性的重要因素，32 ℃时微生物分泌出的裂解性酶的活性相对最高，在其他温度时该酶虽有一定的降解能力，但降解强度下降。

　　3、 结 语

　　（1）从运城盐湖中分离出具有耐盐性的菌株，经过长时间驯化后筛选出对PO生产废水具有较好降解效果的菌株YH-2。该菌株为革兰氏阳性菌（短杆状，无鞭毛，接触酶阳性），幼年菌落为乳白色，干燥不易挑取，随培养时间延长出现半透明淡黄色无规则的黏液层，表面变得湿润。

　　（2）YH-2菌株能在不添加营养物质的废水中逐步适应高盐环境，分泌出断裂有机物键链的酶，使大分子有机物裂解为小分子，并被微生物吸收利用，为微生物繁殖合成新的细胞结构提供必要的碳源、氮源，保证微生物能正常生长繁殖。

　　（3）连续培养3 d后的菌株，在初始pH为10的废水中32 ℃连续降解5 d后，其CODcr降解率（为70.9%）相对最大。这为分离耐盐菌并应用于PO生产废水处理提供了科学的理论依据，驯化、分离筛选出的耐盐菌在用于低成本的PO生产废水处理方面具有良好的可行性。