Rab29调控细胞内甲状旁腺激素受体转运的机制

　　摘要：目的研究Rab29在细胞内的分布以及对甲状旁腺激素受体（PTHR）胞内转运的调控作用。方法采用免疫荧光技术观察Rab29在细胞内的分布；细胞内分别转染野生型Rab29和Rab29两种突变型，免疫荧光技术观察3种Rab29在细胞内的分布；细胞内共转染PTHR和Rab29,免疫荧光技术处理后，在电镜下观察Rab29调控PTHR的胞内分布；半衰期实验检测细胞Rab29基因敲减后PTHR的稳定性。结果Rab29定位于反式高尔基体，Rab29突变型的细胞内定位均由野生型的核周聚集变为细胞内弥散状，Rab29的缺陷导致了PTHR的逆膜转运受损和稳定性下降。结论定位于反式高尔基体的Rab29是逆膜转运通路中不可或缺的一部分，对PTHR的胞内转运起着重要的调控作用。
　　
　　关键词：Rab29;甲状旁腺激素受体；胞内转运；调控。
　　
　　Abstract:Objective To explore the intracellular distribution of the Rab29as well as the regulation of the Rab29in the intracel-lular trafficking of parathyroid hormone receptor（PTHR）。Methods By immunofluorescence technique,the intracellular distribu-tion of the Rab29was observed.Wild type Rab29and two mutant-types of Rab29were transfected respectively and the intracellulardistributions of the three types of Rab29were observed using immunofluorescence technique.Co-transfection of PTHR and Rab29was constructed in cells,and then the intracellular distribution of the PTHR which was regulated by Rab29with the help of electronmicroscope after immunofluorescence treatment had been observed.Using half-life experiment,the stability of the PTHR was testedafter Rab29was knocked-down.Results Rab29located in trans-Golgi apparatus,and the wild-type Rab29exhibited perinuclear pat-tern while the mutant-types were dispersed in cells,the defection of Rab29leaded to the damage of PTHR′s retrograde traffickingas well as its stability.Conclusion Rab29which locates in trans-Golgi is indispensable to retrograde trafficking,and it plays a vitalrole in PTHR′s intracellular trafficking.
　　
　　Key words:Rab29;parathyroid hormone receptor;intracellular trafficking;regulation.
　　
　　甲状旁腺激素受体（PTHR）参与机体骨与钙代谢，在骨质疏松的发生发展中起着重要的作用[1-3].PTHR的胞内转运机制是目前研究的热点[4].Rab29是一种小G蛋白酶，是70多个Rab蛋白家族的一员，已经被证实在囊泡出芽、融合以及保持包膜细胞器的完整性中发挥重要作用[5-7].本研究通过观察Rab29在细胞内的定位，细胞转入Rab29突变型观察PTHR在细胞内的分布以及基因敲除Rab29观察PTHR的稳定性，从而探讨Rab29对甲状旁腺激素受体胞内转运的调控作用。
　　
　　1材料与方法。
　　
　　1.1材料来源。
　　
　　人Rab29、PTHRcDNA序列由Open Biosys-tems（GE Dharmacon,美国）公司提供；Myc-6磷酸甘露糖受体（MPR）的质粒由Nebraska大学的Richard G.MacDonald教授赠与；pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空载体由本实验室提供；10%胎牛血清由Hyclone（美国）公司提供；Hek293和Hela细胞由中国典型培养物保藏中心（CCTCC）提供；脂质体Lipofectamine2000由Invitrogen（美国）提供；电化学发光（ECL）试剂由Sigma（美国）提供。
　　
　　1.2方法。
　　
　　1.2.1细胞培养与转染 用10%胎牛血清完全培养基，在37℃，5% CO2的培养箱中培养Hek293和Hela细胞。常规PCR突变技术获得Rab29-T21N和Rab29-Q67L突 变，将Rab29的编码区插入pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空载体 中 的KpnⅠ/Xbal区，以获得3xFlag/3xHA-Rab29,将PTHR的编码区插入pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空载中的HindⅢ/Xbal区以获得3xFlag/3xHA-PTHR.转染依照转染试剂说明书将受体质粒与Lipofectamine2000（Invitro-gen,美国）混合，在细胞融合度达到70%~80%时进行。
　　
　　1.2.2免疫荧光染色成像技术检测 Rab29在细胞内的定位 将HEK293细胞事先种于铺好L-多聚赖氨酸和基质胶的盖玻片上，分别用Golgin97抗体识别高尔基体，EEA1抗体识别内体，Flag抗体识别3Flag-Rab29,在LSM 510共聚焦显微镜（Zeiss,德 国）下进行免疫荧光测定。用蛋白转 运 抑 制 剂（Brefeldin A）处理转染过3Flag-Rab29的Hela细胞5min,在高尔基体完全碎裂后，使用免疫荧光技术，用Flag抗体识别3Flag-Rab29,TGN46抗体识别反式高尔基体，GM130抗体识别顺式高尔基体。
　　
　　1.2.3免疫荧光染色成像技术检测 Rab29调控逆膜转运通路 研究已经证实MPR是最为经典也是最早发现的逆膜转运中的货物[8].MPR位于高尔基体，负责识别并转运新生成的溶解酶至溶酶体，完成转运后，MPR再经由逆膜转运通路回到高尔基体进行下一轮识别转运[9].在表达Myc-MPR的Hela细胞内分别转染野生型3Flag-Rab29和Rab29的2种突变3Flag-Rab29T21N、3Flag-Rab29Q67L.用免疫荧光技术标记MPR与3种Rab29,在LSM 510共聚焦显微镜下进行免疫荧光测定，观察MPR的细胞内定位。
　　
　　1.2.4半衰期测定检测 Rab29在PTHR胞内转运的作用 设计蛋白质半衰期试验，在Hek293细胞内转入3HA-PTHR、Rab29siRNA或 者3HA-PTHR、scramble Rab29 siRNA.Rab29siRNA用于敲除Rab29,scramble Rab29siRNA作为阴性对照。在细胞 培养基内孵育放线菌酮 （CHX）和100nMPTH（1-34），分别在0、2、4、6h时收集细胞裂解液，之后采用Western blot技术检测每个时间点的PTHR蛋白水平。
　　
　　2结果。
　　
　　2.1 Rab29定位于反式高尔基体 共聚焦显微镜下观察3Flag-Rab29在Hela细胞内成核周聚集分布，并且与高尔基体的标志Golgin97有大量共定位，而与内体的标志EEA1共定位较少，这表明Rab29定位于高尔基体。用Flag抗体识别3Flag-Rab29,TGN46抗体识别反式高尔基体，GM130抗体识别顺式高尔基体。3Flag-Rab29与反式高尔基体开始共同位于细胞核周，并且 有大量共定位，随着高尔基体的整体碎裂，3Flag-Rab29仍然与散在细胞质中的反式高尔基体有大量共定位；反之，3Flag-Rab29与顺式高尔基体开始共同位于细胞核周，并且有大量共定位，随着高尔基体的整体碎裂，3Flag-Rab29几乎不与顺式高尔基体共定位。