比较接种外源菌剂和自然堆肥的两种堆肥处理效果

　　目前，堆肥是解决大量畜禽粪便经济有效的处理方法之一，不仅能解决环境污染问题，还能够将废弃物堆制成肥料或土壤调节剂，施入田中，起到改良土壤和增加肥效的作用。一些研究表明，在人工条件下通过添加外源菌剂可提高堆肥微生物数量，加速堆肥反应进程。

　　许多研究结果已经证实木质纤维素的降解是限制堆肥腐熟进程，并影响堆肥产品品质的关键因素。

　　因此，向堆肥中添加木质纤维素降解菌，并研究这些功能菌株对堆肥的促进作用已经成为近年来许多学者的研究课题。王伟东等人研究表明，接种木质纤维素降解菌使牛粪堆肥中纤维素、半纤维素、木质素的降解率分别比对照提高了 12.8%、3.51% 和 4.78%;许修宏等人利用牛粪和稻草共发酵的研究表明，添加木质素降解菌复合菌剂—黄孢原毛平革菌 (Phanero-chaete chrysosporium) 和变色栓菌 (Thametesversicolor)使堆肥中的纤维素酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶活性均有所增加。然而，目前关于堆肥中木质纤维素降解菌数量变化的研究还相对较少。堆肥中微生物群落由于生境的改变，不断进行着自我调整，因此，堆肥的实质也可以看成是微生物群落结构演替的动态过程。所以，研究堆肥过程中木质纤维素降解微生物生理群的动态变化，有助于全面了解堆肥化过程中木质纤维素的生物降解，进而对提高堆肥效率具有重要现实意义。本试验通过比较接种外源菌剂和自然堆肥的两种不同堆肥处理，监测堆肥中木质纤维素酶活性和木质纤维素含量变化，并结合木质纤维素降解微生物数量的动态变化，了解添加木质纤维素降解菌剂对堆肥中木质纤维素降解的强化作用，为接种剂开发和提高堆肥效率提供理论依据和实践指导。

　　1、 材料与方法

　　1. 1 堆肥材料

　　堆肥材料为新鲜牛粪和水稻秸秆 (调理剂) 。将水稻秸秆铡成5 cm 左右的小段，与鲜牛粪按照1∶3. 5的质量比混合均匀，调节水分含量至 60% ～ 65%，堆成 1 m ×1 m ×1. 2 m 的发酵堆。该堆料有机质含量约为 59. 5%，C/N 约为 30∶ 1，木质纤维素含量为 55. 59%，其中木质素、纤维素、半纤维素比例分别为 6. 84%、24. 37%和 24. 38%。

　　1. 2 堆肥接种及取样方法

　　堆料分 A、B 组，A 组为对照样，进行自然堆肥; B 组添加菌剂 DN －1 (由本实验室选配) ，包括研究木质素降解的模式菌株 － 黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium) ; 兼具木质素、纤维素、半纤维素3 种酶活性的灰略红链霉菌 (Strepto-myces griseorubens) C － 5; 从堆肥中分离得到的具有木质纤维素降解能力且能使堆肥快速升温的 3 株芽孢杆菌 (Bacillus sp. X9、Bacillus sp. L1 和 Bacillussp. L8) 。采用固态接种体，浓度为 1 × 109CFU / g，接种量为10 g/kg，边建堆边添加菌剂，接种后均匀混合堆体材料。

　　采用室内好氧堆肥，自然通风。当温度上升到45℃ 开始翻堆，每 3 d 翻堆 1 次，温度下降到35℃后每 7 d 翻 1 次，直至堆体温度下降至环境温度时结束发酵。堆肥持续 46 d，根据堆体温度变化分别在 1、3、12、18、22、31、46 d 取样分析。采样采取多点采样法，均匀混合样品后，用于测定各理化指标，所有分析取样均采集 3 个平行样。

　　1. 3 测定项目及方法

　　使用 LNI － T UT325 数字电子温度计每天测定环境温度和距堆体顶端 30 cm 处温度。pH 值测定:各时期取 1 g 样品，准确加入 10 mL 蒸馏水，稍作振荡后，放入 120 r/min 摇床振荡 1 h，然后倒入离心管，在6 000 r/min 下离心15 min，将上层清液倒入小烧杯，用数显型 pH 仪测定，实验重复 3 次，取平均值。木质素漆酶活性测定采用 ABTS 法;纤维素和半纤维素酶活性测定采用 DNS 法。木质纤维素含量利用 ANKOM220型纤维分析仪分析测定。木质素和纤维素 (半纤维素) 降解菌数量分别采用愈创木酚选择培养平板计数法和刚果红染色平板计数法分析测定。

　　2、 结果与分析

　　2. 1 堆肥过程中的温度变化

　　温度是影响微生物生长的重要因素，温度变化能很好地反映堆肥的进程。由图 1 可知，堆体的温度变化经历了快速升温、持续高温、降温和腐熟稳定4 个阶段。添加菌剂的堆肥在第3 d 进入高 温 期 (＞ 45℃) ，高 温 期 持 续 20 d (3 ～22 d) 。自然堆肥虽然也在第 3 d 进入高温期，但高温期仅持续14 d，而且高温期的平均温度低于菌剂堆肥。由此可见，加入菌剂可延长堆肥的高温期，提高堆体温度，这样可以更有效地杀死堆肥中的寄生虫和病原微生物，达到无害化目的，促进堆肥腐熟。

　　2. 2 堆肥过程中 pH 值的变化

　　pH 值的大小对微生物的生长有重要影响，也是提示堆肥分解程度的标志之一。一般认为，堆肥pH 值在 8 左右可获得最大堆肥速率，由图 2 可知，不同堆肥处理的 pH 值均在 7. 8 ～9. 0 之间，可满足好氧堆肥对 pH 值的要求。两种处理在堆肥初期均呈先下降后上升的趋势，这可能是由于初期可利用的有机质较多，微生物生命活动旺盛，产生大量有机酸，降低了堆体 pH 值水平; 随后有机酸随着温度的升高而挥发，同时含氮物质降解产生 NH+4的不断积累，从而使堆体的 pH 值又逐渐升高。在整个堆肥过程中菌剂处理的 pH 值均略低于自然堆肥，说明加入菌剂可降低堆料 pH 值，这样可以减少发酵过程中的氨挥发，有助于提高堆肥肥效。

　　2. 3 堆肥过程中木质纤维素酶活性变化

　　堆肥中的一切生物化学过程都是在酶的参与下进行的，酶的活性大小可以反映有机物料堆制中各种生物化学过程的方向和强度。

　　2. 3. 1 羧甲基纤维素酶和滤纸酶活性的变化

　　由图 3 可见，虽然两种处理中纤维素酶活性均呈现先升后降的趋势，但菌剂堆肥的纤维素酶活性在各时期均高于自然堆肥，说明加入菌剂能更有效地提高堆肥中的纤维素酶活性。菌剂堆肥中 CMC酶和滤纸酶活性的最高值分别为 1 120、268 U/L，而自然堆肥中仅分别为 161、59 U/L。其中 CMC酶活性明显高于滤纸酶活性，这是由于酶对水溶性底物 (CMC － Na) 有较高的活性，而滤纸与酶是多相催化，所以反应的空间阻碍较大。

　　2. 3. 2 半纤维素木聚糖酶活性变化

　　木聚糖酶是促进半纤维素降解的主要生物催化剂，可将其主要成分木聚糖降解为木糖或低聚糖。从图 4 中可见，接菌处理的堆肥在发酵的前 12 d 内，木聚糖酶活性达到整个发酵过程的最高值 1 681 U/L，直到发酵结束，仍然有高达 1 210 U/L 的活性。而自然堆肥过程中木聚糖酶活性最高值仅为 770 U/L。可见，菌剂中微生物具有持续高产木聚糖酶的特性，显示了对堆肥中半纤维素成分很强的降解能力。另外，由于半纤维素与木质素以化学键连接存在，组成木质素 － 碳水化合物复合体，半纤维素酶催化水解复合体的碳水化合物部分，这也同时有利于复合体的溶出。

　　因此，菌剂中微生物持续高产半纤维素木聚糖酶的特性对于堆肥中木质素的降解也起到重要作用。

　　2. 3. 3 漆酶活性变化

　　漆酶是一种含铜多酚氧化物，能够催化酚类物质氧化还原，在木质素降解中发挥重要作用。

　　由图 5 可见，菌剂堆肥中的漆酶活性变化呈较明显的双峰; 1 ～18 d 缓慢升高，并在第 18 d 达到最高值 4 666 U/L (自然堆肥仅为 1 700 U/L) ，之后逐渐下降; 在第 31 d 又达到第二次峰值 3 666 U/L，由此可以推测，木质素在堆肥稳定期很可能又有较高强度的降解。而自然堆肥的漆酶活性除了在堆肥前期略有提高，整个堆肥过程中的酶活性始终保持在1 000 U/L左右，远远小于菌剂堆肥中的酶活性。说明加入菌剂能够大大提高堆肥中的漆酶活性，更加有利于木质素的分解。

　　2. 4 堆肥中木质纤维素降解菌数量及木质纤维素降解率变化

　　微生物是好氧堆肥过程的工作主体，在堆肥反应中对有机物的降解起着主导作用。在该过程中每一个微生物种群都在相对较短时间内适应生长繁殖的环境条件，并对某一种或某一类特定的有机质的分解起作用。木质纤维素降解微生物种群的测定对了解堆肥各个阶段木质纤维素降解机理及降解主导者有着重要意义，其中木质纤维素降解菌的数量是一个必不可少的研究参数。

　　图 6、7、8 所示为堆肥过程中木质素、纤维素、半纤维素降解菌数量的变化动态。由图可知，添加菌剂的堆肥在各时期木质纤维素分解菌的数量均高于自然堆肥，表明接种功能菌剂，能够明显增加堆层中降解木质纤维素的微生物总数。接菌处理中木质素降解菌数量呈现阶段性变化，分别在第12和 31 d 达到两次峰值 (图 6) ; 纤维素和半纤维素分解菌数量均在第 3 d 达到峰值，明显早于木质素降解菌 (图 7 和图 8) ，这一变化与木质纤维素酶活性峰值变化较一致。

　　表 1 为木质素、纤维素和半纤维素在堆肥各个时期的降解率变化，最终添加菌剂的堆肥中木质素、纤维素和半纤维素的降解率分别为 42. 54%、62. 57% 、67. 14% ，分别高出自然堆肥 14. 33% 、31. 31% 、19. 57% 。此结果表明，添加菌剂明显提高了堆肥中木质纤维素的降解程度。

　　3、 讨论

　　木质素含量在堆制过程中升高是很多研究所得的结果，原因在于木质素较其他有机质难以降解。木质素是由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接而成的聚酚类三维网状高分子芳香族化合物，其与半纤维素侧链共价结合，是微生物降解碳水化合物的障碍之一。而且，木质素的障碍作用不仅表现为物理屏障，其中含有的酚类化合物还可以抑制微生物的降解活性。有些研究者甚至据此认为木质素在堆肥化过程中不发生降解。

　　事实上，本研究中木质素发生了显著的降解。在添加菌剂的堆肥中，堆制前 3 d 木质素几乎不被降解(降解率仅为 0. 73%) ，但当温度开始逐渐升高，木质素降解率也逐渐增加，高温期 (3 ～ 22 d) 结束时，木质素降解率为 29. 97%，显然，高温期是木质素加快降解的时期，之后随着温度的降低，木质素降解逐渐减缓。但进入二次发酵后期(31 ～ 46d) ，木质素含量又有较大程度降低，最终降解率高达 42. 54%。郁红艳在研究农业废物堆肥的过程中也得到木质素降解主要发生在高温以及二次发酵后期的相似的结论。此外，本实验菌剂处理的木质素酶 (漆酶) 活性在第 18 d 和第 31 d 出现两次峰值; 木质素降解菌的数量在第 12 d 和第 31 d 出现两次峰值，二者变化都与木质素降解率的变化较一致，这样也从微生物生理和生态角度进一步印证了高温期和二次发酵后期是木质素降解较为活跃的阶段。

　　4、 结论

　　堆肥过程中加入菌剂可提高堆体温度，延长堆肥高温期，降低堆肥 pH 值。

　　添加菌剂可有效增加堆层中木质纤维素降解微生物总数; 明显提高木质纤维素酶活性; 堆肥结束时，添加菌剂的堆肥中纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别比对照提高了 31. 31%、19. 57% 和14. 33% ，其中木质素降解主要发生在高温期和二次发酵后期。

　　参考文献:
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